《疫學檢測方法》PPT課件

《《疫學檢測方法》PPT課件》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《《疫學檢測方法》PPT課件（41頁珍藏版）》請在裝配圖網上搜索。

1、 免疫學檢測方法免疫學檢測方法 n免疫學檢測方法免疫學檢測方法主要包括酶聯免疫吸附檢測和放射免疫技術,該方面的研究取得了長足的發展。由于該方法操作簡單，前處理簡化，檢測快速、準確、敏感，檢驗成本低，檢測容量大，可同時進行大批量樣品檢測。因此具有潛在的廣泛應用價值。n免疫學檢測技術是近幾年發展起來的新技術，主要包括放射免疫技術、免疫酶技術、免疫熒光技術和免疫電鏡技術等，現已廣泛地應用于各個領域中。n10多年前，一些研究者開始嘗試把放射免疫和免疫酶技術用于食品農藥殘留檢測，并取得極大成功。n其中應用最多的是固相放射免疫飽和分析技術和酶聯免疫吸附檢測技術。n在這些檢測技術中其核心反應都是抗原抗體反應

2、。所謂抗原是指一切具有抗原性的物質：n抗體(又稱免疫球蛋白)，是由抗原刺激機體而產生的特異性球蛋白。n作為抗原(完全抗原)需要包括兩個方面的特性：免疫原性和反應原性。n免疫原性是指能夠刺激機體產生抗體或誘導機體形成免疫回答反應的特性。n反應原性是指能夠與其誘導產生的抗體或致敏淋巴細胞發生反應的特性。完全抗原是一些大分子物質(分子量大于l萬)，如蛋白質等。n如果一種抗原只有反應原性而沒有免疫原性則稱為不完全抗原(半抗原)，它通常是一些小分子物質(分子量小于1000)，必須與其它大分子物質結合后才具有免疫原性。各種農藥屬于這類物質，不具有免疫原性因此農藥殘留的免疫學方法檢測要較醫學等領域中致病微生

3、物等完全抗原的免疫學方法檢測復雜得多。n農藥殘留酶聯免疫，首先要把農藥與載體蛋白連接起來，形成農藥一載體蛋白結合物免疫原，才可用來免疫動物制備抗體。因此能否合成穩定、具有良好免疫原性的農藥一載體蛋白結合物是整個農藥殘留免疫學檢測技術研究的關鍵。農藥免疫學檢測技術的原理農藥免疫學檢測技術的原理n農藥免疫學檢測應用最多的兩種固相免疫技術是固相放射免疫技術和酶聯免疫吸附檢測技術。n固相放射免疫技術是采用標記抗原與未知抗原競爭限定量的固相抗體結合位點，然后通過測定抗原一抗體結合物中放射性強度的改變，確定未知抗原的存在及含量。酶聯免疫（ELISA）nELISA是通過在合適的載體上，酶標限定量抗原與未知抗

4、原競爭固相抗體結合位點或固相抗原與未知抗原競爭限定量的標記抗體結合位點，形成抗體復合物。在一定底物參與下，復合物上的酶催化底物，使其水解、氧化或還原成另一種帶色物質。由于酶的降解底物與顯色是成正比的，通過眼觀或分光光度計測定，從而確定是否存在未知抗原或含量。n但由于放射免疫技術涉及放射材料的使用和經常制備放射標記物，檢測設備也比較昂貴，所以越來越多地被較為安全、簡便的ELISA方法取代。n在利用免疫技術進行農藥定量檢測時，需要制備標準曲線，之后根據制備好的標準曲線即可對農藥殘留進行定量。免疫原的合成及酶標抗原的制免疫原的合成及酶標抗原的制備備n 由于農藥屬半抗原，不具有免疫原性，因此在制備抗體

5、前首先要合成農藥一載體蛋白結合物免疫酶原。由于各種農藥分子結構不同各研究者所采用的方法也不一樣，但在絕大部分情況下由于農藥分子不具備連接反應基團，農藥分子首先要經過衍生，之后通過連接物與載體蛋白連接。n常用的裁體蛋白有牛血清白蛋白、人血清白蛋白和卵清蛋白等。農藥衍生和連接的化學反應條件n不能導致半抗原分子結構發生明顯改變，否則抗原性將發生變化。n另外，制備好的半抗原結合物在免疫動物前，要測定結合物中半抗原數目因為結合中半抗原分子數目太多或太少，誘發抗體的能力都很差。用于合成農藥一載體蛋白結合物的方法，在不引起酶失活情況下通常都可用來連接酶與農藥分子，制備酶標農藥抗原?？罐r藥抗體的制備抗農藥抗體

6、的制備n 抗農藥的多克隆抗體可用農藥一載體蛋白結合物直接免疫兔子等動物之后每間隔一個月加強免疫一股6個月左右可獲得滿意效價的抗血清。如果結合物免疫原性較差，則需要甚至長達1年的免疫才能獲得滿意效價的抗血清。n多克隆抗體雖然具有生產成本低、生產方法簡便等特點，但由于其特性隨動物種類及個體差異而有變化，而且生產數量也受限制，因此不利于生產大批量商品試劑盒。n單克隆抗體可通過用毒素載體蛋白結合物免疫小白鼠等之后建立雜交瘤細胞系來生產。單克隆抗體雖然生產成本高、技術復雜，但其特性穩定，交叉反應少，并可大批量生產，在生產商品試劑盒上很有價值。食品農藥殘留免疫學檢測技術食品農藥殘留免疫學檢測技術的應用的應

7、用 自從10多年前開始嘗試把免疫學技術應用于食品農藥殘留檢測以來，食品農藥殘留免疫學檢測技術研究工作取得了極大的進展，已有大量檢測農藥(殺菌劑、除草劑、殺蟲劑)的研究文獻報道。檢測的食品范圍很廣包括水果、蔬菜、飲料、啤酒、葡萄酒、魚、肉、豬油、奶、植物油、蜂蜜、豆類、谷物及谷物加工產品等。n該方法不僅可用來定性篩選，而且也可以用來定量分析，其檢測水平在很多農藥可達到納克(ng)甚至皮克(pg)水平。n另外一些檢測的商品試劑盒也研制開發出來，并可用于食品中一些農藥的殘留檢測。n在美國有關官方機構，如環境保護署(EFA)，農業部食品安全檢驗司(PSISUSDA)和AOAC已制定廠農藥殘留免疫學檢驗

8、商品試劑盒評定和認可的建議準則。n隨著農藥殘留免疫學檢測技術不斷被完善和商品化(生產出試劑盒)，免疫學檢測技術會成為食品農藥殘留和食品安全質量控制的有效快速的檢測手段。n除草劑類農藥殘留免疫學檢測技術研究的一些文獻報道(國內尚未見有關的研究報道)，簡述了方法類型、檢出限、抗體類型、檢測食品范圍和檢測農藥種類等有關情況，另外還列出了一些已獲得應用的商品試劑盒。n農藥殘留免疫學檢測技術與傳統的色譜、質譜法相比所需設備簡單(如ELISA方法只需一臺酶標儀)，或者不需檢測設備加樣后直接進行眼觀判定即可，適合于現場應用，前處理程序簡化(不需凈化)，檢驗快速，檢測容量大檢驗成本低。n液體食品如牛奶、果汁、

9、菜汁等通常不需要前處理可直接取樣檢測。檢驗操作幾十分鐘至幾個小時內即可完成，凈化和濃縮可進一步提高檢出限。n固體食品如谷物等經抽提劑抽提、濃縮并重新溶于水溶液中即可取樣檢測，不需凈化檢驗操作(不包括前處理)可在幾十分鐘至幾個小時內完成。n檢測容量，試管法每次最多可同時分析十幾個樣品，如果使用磁珠技術每次可同時分折3040個樣品n微量酶標板法(96孔)每次可同時分折44個樣品并且可同時做曲線。n盡管免疫學檢測技術中農藥與抗農藥抗體反應是高度特異的，但由于該反應敏感性特別高，有時盡管底物的成分輕微干擾了農藥與抗農藥抗體的結合，這時如果參照用緩沖溶液來制備的標準曲線定量，會產生一個低的假陽性應答，從

10、而干擾檢測結果。這種情況可通過用不含農藥的樣品抽提物制備標準曲線來消除干擾，也可通過對樣品抽提物進行高倍稀釋來消除，但后者同時會降低檢測敏感性。n免疫學檢測系統中的抗農藥抗體對于結構非相關的靶抗原農藥表現極高的特異性，但某些與檢測農藥結構密切相關的農藥，或待檢農藥的代謝產物可能與抗待撿農藥抗體發生不同程度的交叉反應。如果樣品中存在這些物質該農藥的定量檢測就會降為半定量或定性撿測。但從另一個角度看，這種交又反應又是特別有用的利用這種交叉反應可用抗一種農藥的抗體對包括母農藥在內的結構密切相關的類似物及代謝產物進行多殘留檢測。n 另外有研究者認為可以把抗幾種結構相關或非相關的農藥抗體混合利用這種混合抗體進行幾種農藥多殘留分析對于檢測大批量且農藥污染又沒有規律的樣品，可以節省大量的時間和工作量。同時免疫學技術的這種定性篩選檢測與色譜、質譜定量檢測結合體使用更為方便。