《目的基因的獲取》PPT課件

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1、目的基因：目的基因：準備要分離、改造、擴增或表達的基因。準備要分離、改造、擴增或表達的基因。結構基因的組成轉錄啟動區核糖體識別區編碼區轉錄終止區起譯碼ATG開讀框休止碼TAG、TAA、TGA目的基因的獲取方法目的基因的獲取方法1、直接分離法、直接分離法2、基因文庫分離法3、PCR分離法4、化學合成法比較各種方法獲得目的基因的優缺點一、限制性內切酶法一、限制性內切酶法用限制性內切酶把基因組用限制性內切酶把基因組DNA切成不同切成不同大小的片斷。大小的片斷。酶切酶切由于帶有粘性末端，產物可以直接與載由于帶有粘性末端，產物可以直接與載體連接。體連接。2.缺點缺點目的基因目的基因內部內部也可能有該內切

2、酶的切點。也可能有該內切酶的切點。目的基因也被切成碎片！目的基因也被切成碎片！BamH IBamH IBamH Igene適合于從簡單的基因組中分離目的基因從簡單的基因組中分離目的基因,如質?；虿《镜拇笮≈挥袔浊A基,大的也超不過幾十萬堿基,編碼基因比較少,獲得也比較簡單.應用對象應用對象1、對已定序列的、對已定序列的DNA分子分子，只需要用已知識別序列的限制性內切酶進行一次或幾次切割，分離純化所需要的DNA片斷，與適當載體連接。2、對已知定位的目的基因、對已知定位的目的基因，只要根據目的基因兩側的已知的酶切識別位點，一次就可以獲得。3、即使含目的基因的、即使含目的基因的DNA分子未定序或定位

3、分子未定序或定位，也只須通過酶切分析，隨后再通過部分酶切，構建一個簡單的基因文庫，從鉤出目的基因。1.限制性內切酶局部消化法限制性內切酶局部消化法控制內切酶的用量和消化時間，使基控制內切酶的用量和消化時間，使基因組中的酶切位點只有一部分被隨機因組中的酶切位點只有一部分被隨機切開。切開。內切酶識別位點的堿基數內切酶識別位點的堿基數影響所切出的產物的長度和隨機程度。影響所切出的產物的長度和隨機程度。1）4bp的內切酶的內切酶平均每平均每46（4096）bp一個切點。一個切點。2）6bp的內切酶的內切酶平均每平均每44（256）bp一個切點。一個切點。隨機程度高。如隨機程度高。如Hae、AluI、S

4、au3A。內切酶粘性末端內切酶粘性末端能與常用克隆位點相連。能與常用克隆位點相連。（Sau3ABamH I）（1）超聲波）超聲波超聲波強烈作用于超聲波強烈作用于DNA，可使其斷，可使其斷裂成約裂成約300bp的隨機片斷。的隨機片斷。（2）高速攪拌）高速攪拌1500轉轉/分下攪拌分下攪拌30min，可產生約，可產生約8kb的隨機片斷。的隨機片斷?；驹恚篋NA分子的兩條鏈存在著GC、AT堿基配對，其中其中GC間存在間存在3個氫鍵、個氫鍵、AT間存在間存在2個氫鍵，個氫鍵，如果不同基因片段的堿基組成差異較大，其理化性質，如浮力密度和解浮力密度和解鏈溫度等也明顯不同，鏈溫度等也明顯不同，采用相應的

5、方法即可達到從生物基因組中分離目的基因的目的。密度梯度離心法非洲爪瞻5SDNA單鏈酶解法根據其熱穩定海膽DNA目的基因的獲取方法1、直接分離法、直接分離法2、基因文庫分離法、基因文庫分離法3、PCR分離法4、化學合成法 將某種生物細胞的將某種生物細胞的整個基因組整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將切割成大小合適的片斷，并將所有這些所有這些片斷片斷都與適當的載體連接，引入相應的都與適當的載體連接，引入相應的宿主細胞中宿主細胞中保存和擴增保存和擴增。理論上講，這些重組載體上帶有了該生理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的物體的全部基因全部基因，稱為基因文庫。，稱為基因文庫。一、基因文庫的構

6、建一、基因文庫的構建1.基因文庫（基因文庫（gene library）（2 2）目前常用的載體目前常用的載體 載體能夠容載的載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構片斷大小直接影響到構建完整的基因文庫所需要的建完整的基因文庫所需要的重組子重組子的數目。的數目。載體容量越大，所要求的載體容量越大，所要求的DNA片斷數目片斷數目越少，所需的越少，所需的重組子重組子越少。越少。（1 1）對載體的要求）對載體的要求 載體系列：載體系列：容量為容量為 36.451 kp cosmid載體：載體：容量為容量為 45 kb YAC：容量為容量為 230kb-1700kbBAC:容量為容量為 300 kb斷點

7、完全隨機，片斷長度合適于載體連接。斷點完全隨機，片斷長度合適于載體連接。（1）染色體）染色體DNA大片段的制備大片段的制備超聲波（超聲波（300bp）或機械攪拌（）或機械攪拌（8kb）。）。物理切割法：物理切割法：內切酶內切酶Sau3A進行局部消化?？傻玫竭M行局部消化?？傻玫?0-30kb的隨機片斷。的隨機片斷。酶切法：酶切法：粘性末端直接連接粘性末端直接連接載體與外源載體與外源DNA大片段的兩個末端大片段的兩個末端都有相同的粘性末端。都有相同的粘性末端。如：如：Sau3A與與BamHI的酶切末端。的酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾。直接連接、人工接頭或同聚物加尾。人工合成的限制性內切

8、酶粘性末端片斷。人工合成的限制性內切酶粘性末端片斷。各種酶的接頭可以向公司定做或購買。各種酶的接頭可以向公司定做或購買。接上人工接頭接上人工接頭粘性末端粘性末端CCCCCC末端轉移酶末端轉移酶粘性末端粘性末端 同聚物加尾同聚物加尾一個文庫要包含一個文庫要包含99%的基因組的基因組DNA時所時所需要的克隆數目。需要的克隆數目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫包含了整個基因組文庫包含了整個基因組DNA的概率（的概率（99%）f:插入載體的插入載體的DNA片斷的平均長度占整個基因片斷的平均長度占整個基因 組組DNA的的百分數百分數N：所需的重組載體數（克隆數）：所需的重組載體數（克隆數）例如

9、：人的基因組是例如：人的基因組是 3109 bp，插入，插入DNA片斷的平均長度如果是片斷的平均長度如果是104 bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=GfN=GfG：Genome大??；大??；f：fragment大小大小N=Gf=31091.7104=1051.cDNA以以mRNA為模板為模板逆轉錄逆轉錄出的出的DNA稱稱cDNA。2.cDNA librarymRNAcDNA3 3 5 5 反轉錄酶反轉錄酶引物引物利用某種生物的利用某種生物的總總mRNA合成合成cDNA，再將，再將這些這些cDNA與載體連接，轉入細菌細胞中進與載體連接，轉入細菌細胞中進行保存和

10、擴增，稱行保存和擴增，稱cDNA文庫。文庫。（1）總）總RNA（total RNA）提?。┨崛?.cDNA文庫的特點文庫的特點提取總提取總RNA有商業化的試劑盒（有商業化的試劑盒（kit）。）。分離分離mRNA用商業化的用商業化的Oligo dT纖維柱。纖維柱。利用利用mRNA都含有一段都含有一段polyA尾巴，尾巴，將將mRNA從總從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。等）中分離純化。mRNA只占總只占總RNA的的1%-2%。原理原理 mRNA的分離純化的分離純化Column（柱）（柱）反轉錄酶反轉錄酶 cDNA第一鏈合成第一鏈合成逆轉錄酶能以逆轉錄酶能以RNA為模板合成為模板合成c

11、DNA。用用Oligo dT（或隨機引物）作引物，合（或隨機引物）作引物，合成成cDNA的第一鏈。的第一鏈。mRNAcDNA3 5 5 AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物引物用用堿堿處理或用處理或用RNaseH降解降解mRNA-DNA雜交分子中的雜交分子中的mRNA。mRNAcDNA3 3 5 5 反轉錄酶反轉錄酶引物引物mRNAcDNA第一鏈第一鏈3 3 5 5 引物引物cDNA第一鏈第一鏈3 5 引物引物或或RNaseH堿堿剩下的剩下的cDNA單鏈的單鏈的3末端一般形成一個末端一般形成一個彎彎回來的雙鏈發卡結構回來的雙鏈發卡結構（機理不明），可成（機理不明），可成為合成第二條

12、為合成第二條cDNA鏈的引物。用鏈的引物。用DNA聚聚合酶合成第二鏈合酶合成第二鏈DNA.。cDNA第一鏈第一鏈5 cDNA第二鏈合成第二鏈合成DNA聚合酶聚合酶cDNA第一鏈第一鏈cDNA第二鏈第二鏈5 3 核酸酶核酸酶S1用用核酸酶核酸酶S1可以切掉發卡結構（但這會可以切掉發卡結構（但這會導致導致cDNA中有用的序列被切掉?。?。中有用的序列被切掉?。?。cDNA第一鏈第一鏈cDNA第二鏈第二鏈5 3 cDNA第一鏈第一鏈cDNA第二鏈第二鏈5 3 5 3 這種酶能識別這種酶能識別mRNA-cDNA雜交分子中的雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小，并將其降解成許多小片斷片斷。小片斷正好成為

13、小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，聚合酶的引物，用來合成用來合成岡崎片斷岡崎片斷。DNA Pol I除去引物并修補后再使用除去引物并修補后再使用DNA連接酶連接酶連成一整條連成一整條DNA鏈。鏈。mRNAcDNA3 5 反轉錄酶反轉錄酶引物引物mRNAcDNA第一鏈第一鏈3 5 引物引物mRNAcDNA第一鏈第一鏈3 5 mRNAmRNADNA 聚合酶聚合酶DNA 聚合酶聚合酶cDNA第二鏈第二鏈cDNA第一鏈第一鏈3 5 RNaseHDNA ligase去引物去引物在雙鏈在雙鏈cDNA末端接上末端接上人工接頭人工接頭，即可與，即可與載體連接，轉入受體菌。載體連接，轉入受體菌?；蚪柚蚪柚┒?/p>

14、轉移酶末端轉移酶給載體和雙鏈給載體和雙鏈cDNA的的3端分別加上幾個端分別加上幾個C或或G，成為粘性末端。，成為粘性末端。接上人工接頭接上人工接頭粘性末端粘性末端CCCCCC末端轉移酶末端轉移酶一個一個cDNA文庫要包含文庫要包含99%的的mRNA時時所需要的克隆數目。所需要的克隆數目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文庫包含了完整文庫包含了完整mRNA的概率（的概率（99%）:某一種低豐度（不足某一種低豐度（不足14份拷貝）份拷貝）mRNA占細胞整個占細胞整個mRNA的比例的比例N：所需的重組載體數（克隆數）：所需的重組載體數（克隆數）1n1n7.cDNA文庫與基因組文庫相比的優越性表現在

15、1、cDNA文庫以文庫以mRNA為材料，特別適用于某些為材料，特別適用于某些RNA病病毒，毒，例如流感病毒；因其不通過DNA中間體，所以研究其唯一的方法就是cDNA克隆。2、cDNA基因文庫的篩選比較簡單易行基因文庫的篩選比較簡單易行。他的文庫所含的克隆數是基因文庫的十分之一，或更少。3、由于每一個由于每一個cDNA克隆都含有一種克隆都含有一種mRNA序列序列，這樣，這樣在目的基因的選擇中出現假陽性的概率在目的基因的選擇中出現假陽性的概率比較低比較低，而相比，而相比之下基因組文庫克隆的選擇較復雜，假陽性的概率就高。之下基因組文庫克隆的選擇較復雜，假陽性的概率就高。4、cDNA克隆可用于在細菌中

16、能進行表達的基因克隆，克隆可用于在細菌中能進行表達的基因克隆，直接應用于基因工程操作。直接應用于基因工程操作。原因是：高等真核生物與原核生物在結構組成上的最大區別是前者含有內含子間隔序列含有內含子間隔序列，而后者沒有。通過基因文庫中篩選的目的基因難以在原核生物中表達。而cDNA是經過轉錄后得來的其內含子部分已被刪除。5、cDNA克隆還可以用于真核細胞克隆還可以用于真核細胞mRNA的結構和的結構和功能的研究功能的研究一種特異的mRNA在細胞中往往占很小的比例，難以直接研究其序列、結構和功能。一般是通過比較基因組進行確定8.cDNA文庫與基因組文庫相比的缺點1、受材料來源的影響 2、遺傳信息量有限

17、3、構建的cDNA文庫中高豐度的（含量）mRNA含量比低豐度的易得和分離，其實現在構建的cDNA基本上是高豐度的而低豐度的很少用目的基因探針與文庫中的重組用目的基因探針與文庫中的重組載體進行載體進行Southern blot雜交。雜交。文庫文庫載體載體探針探針電泳后雜交電泳后雜交放射自顯影放射自顯影測序分析測序分析目的基因的獲取方法1、直接分離法、直接分離法2、基因文庫分離法3、PCR分離法4、化學合成法 如果知道目的基因的全序列知道目的基因的全序列或其兩端的序列，通過合成一對與引物互補的引物，就可以十分有效的擴增出所需的目的基因。省時省力1.直接從基因組中擴增直接從基因組中擴增（1）提取基因

18、組）提取基因組DNA作模板作模板（2）根據目的基因序列設計引物）根據目的基因序列設計引物（3）PCR擴增擴增真核生物基因組含有內含子！真核生物基因組含有內含子！適合擴增原核生物基因。適合擴增原核生物基因。原核基因組部分原核基因組部分原核細胞原核細胞提取基因組提取基因組DNAPCR擴增擴增（1）提取基因組）提取基因組 total RNA（2）反轉錄合成總）反轉錄合成總cDNA作模板作模板（4）PCR擴增擴增（3）根據目的基因序列設計引物）根據目的基因序列設計引物原核生物不易得到原核生物不易得到mRNA，也不含有，也不含有polyA尾。尾。適合擴增真核生物基因。適合擴增真核生物基因。目的基因目的基

19、因 的引物的引物1反轉錄成目的基因反轉錄成目的基因cDNA第一鏈第一鏈目的基因目的基因 的引物的引物2目的目的 基因基因cDNA第二鏈第二鏈PCRmRNA值得注意的是值得注意的是常規PCR，可以合成的DNA片段長度有限，一般在1KB以內，大于他擴增效果顯著下降。？未知序列的DNA更長的DNA特殊類型的PCR1、套式PCR（nested PCR）利用兩對引物，從一個模板的同一區域擴增出不同長度而設計的特殊方法。他較常規PCR靈敏度大大提高，同時也能有較強的特異性。2、不對稱PCR利用引物濃度不同（50：1或100：1）-單鏈DNA，用作DNA序列分析的模板。3、反向PCR未知序列的一種PCR方法

20、條件為：條件為：此未知序列的某側序列必須已知此外，還有錨定PCR，長程PCR，鍋柄PCR，等等目的基因的獲取方法1、直接分離法、直接分離法2、基因文庫分離法3、PCR分離法4、化學合成法1976年年H.G.Khorana提出了用化學方法提出了用化學方法合成基因的設想，并于合成基因的設想，并于1979年在年在science上發表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨上發表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸酸tRNA基因的論文?；虻恼撐?。一、目前常用的方法一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸二酯法、磷酸三酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法固相合成法自動化合成法。自動化合成法。保護保護dNT

21、P的的5端端P 或或3端端-OH 用酸或堿的脫保護用酸或堿的脫保護（1）原理）原理 帶保護的單核苷酸連接帶保護的單核苷酸連接保證合成反應的定向進行。保證合成反應的定向進行。帶帶5保護的單核苷酸與帶保護的單核苷酸與帶3保護的另保護的另一個單核苷酸以一個單核苷酸以磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵連接起來。連接起來。具體做法：將一個大的保護基團，如芳香磺酰氯（ArSO2Cl）或二環己基碳二亞胺（DCC）加到脫氧核苷酸的3或5羥基上。這樣，具有5-保護的單核苷酸，便能夠通過它的5-OP同另一個3-保護的單核苷酸的3-OH之間定向地形成一個二酯鍵，從而使它們縮合成兩端都受保護的二核苷酸分子。實驗中使用的各種不同的保

22、護基團，有些可以通過酸處理移去，有些可以通過堿處理移去。所以不論是5-的保護基團還是3-的保護基團，都可以通過酸或堿的脫保護作用而除掉。這樣的一個帶5-保護的合成的二核苷酸分子，又能夠同另一個帶3-保護的單核苷酸或二核苷酸進行第二次縮合反應，形成一個三核苷酸或四核苷酸分子。原理與磷酸二酯法一樣。只是參加反應的原理與磷酸二酯法一樣。只是參加反應的單核苷酸都是在單核苷酸都是在3端磷酸和端磷酸和5-OH上都先上都先連接了一個保護基團。連接了一個保護基團。將第一個核苷酸的將第一個核苷酸的3-OH端固定在端固定在固相支持物固相支持物上。上。固相磷酸三酯合成法固相磷酸三酯合成法是目前通用的合成方法。是目前

23、通用的合成方法。15合成的二核苷酸連接處有三個酯鍵！合成的二核苷酸連接處有三個酯鍵！固相支持物固相支持物結果是全保護的結果是全保護的DNA：5 DMT,3固相支固相支持物持物,核苷酸之間對氯苯。最后脫保護核苷酸之間對氯苯。最后脫保護固相固相 支持物支持物固相固相 支持物支持物C化學合成的化學合成的DNA片斷一般在片斷一般在200bp以內。以內。用用T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶使各個片段的使各個片段的5端端帶上磷酸。帶上磷酸。1.互補連接法互補連接法預先設計合成的片斷之間都有預先設計合成的片斷之間都有互補互補區域區域，不同片斷之間的互補區域能，不同片斷之間的互補區域能形成有形成有斷點斷點的完整雙

24、鏈。的完整雙鏈。（2 2）5端磷酸化端磷酸化（1 1）互補配對）互補配對（合成的（合成的DNADNA單鏈的單鏈的55端是端是-OH-OH）T4 DNA連接酶連接酶T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶使使5-OH磷酸化磷酸化完整的完整的DNA雙鏈雙鏈預先設計的片斷之間有預先設計的片斷之間有局部互補區局部互補區，可以，可以相互作為另一個片斷延長的引物，用相互作為另一個片斷延長的引物，用DNA聚合酶聚合酶延伸成完整的雙鏈。延伸成完整的雙鏈。3 5 5 3 5 3 T4DNA連接酶連接酶Klenow片段片段引物引物1.直接合成基因直接合成基因2.合成引物（合成引物（20mer左右）左右）（1 1）mRNA的含量很低，很難作的含量很低，很難作cDNA 3.合成探針序列合成探針序列4.定點突變合成定點突變合成合成帶有合成帶有定點突變定點突變的基因片斷。的基因片斷。（2）有些基因比較短，化學合成費用較低）有些基因比較短，化學合成費用較低5.合成人工接頭或銜接物合成人工接頭或銜接物含有各種酶切位點含有各種酶切位點人工接頭人工接頭（Adaptor）或）或銜接物銜接物（Linker）序列。）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor