測序技術在醫學領域

《測序技術在醫學領域》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《測序技術在醫學領域（66頁珍藏版）》請在裝配圖網上搜索。

1、二代測序技術在醫學領域中的二代測序技術在醫學領域中的應用應用魏冬凱魏冬凱 概要概要 二代測序技術簡介 常見醫學領域NGS方案 石蠟包埋樣本解決方案 CTC和ctDNA二代測序技術簡介人類基因組人類基因組Human GenomeHuman Genome 30億對堿基來自母親 30億對堿基來自父親 線粒體基因組來自母親 與人類共生的微生物基因組DNADNA的構成的構成末端終止法測序ABI 3700(ABI 3730)人類基因組計劃人類基因組計劃(HGP)(HGP)人類基因組計劃(human genome project,HGP)是由美國科學家于1985年率先提出，于1990年正式啟動的。美國、英國

2、、法國、德國、日本和我國科學家共同參與了這一預算達30億美元的人類基因組計劃。按照這個計劃的設想，最終要把人體內約4萬個基因的密碼全部解開，同時繪制出人類基因的譜圖。換句話說，就是要揭開組成人體4萬個基因的30億個堿基對的秘密。人類基因組計劃與曼哈頓原子彈計劃和阿波羅計劃并稱為三大科學計劃。被譽為生命科學的“登月計劃”。Celera GenomicsCelera Genomics Craig Venter成立 第一個使用全基因組鳥槍法測序 使用330臺ABI 3700，購買當時世界排名第三的服務器進行運算，花費3個月時間對Venter的基因組進行測序，得到20GB數據。VentorVentor

3、基因組測序基因組測序 基于分子克隆，必須將DNA片段克隆至大腸桿菌中，否則無法測序。每次末端終止反應體系10ul，其中含有1013個DNA分子，但每次只能測其中1條。預計花費2億美金，最終花費30億美金！怎樣才能降低試劑消耗？降低消耗的辦法降低消耗的辦法1.將分子克隆替換成聚合酶鏈式反應（PCR），先給DNA片段加上尾巴。橋式PCR2.降低反應體積把測序反應裝到小的空間里去。10ul的試劑做更多的DNA測序反應。降低消耗的辦法降低消耗的辦法1.將分子克隆替換成聚合酶鏈式反應（PCR），先給DNA片段加上尾巴。橋式PCR2.降低反應體積把測序反應裝到小的空間里去。10ul的試劑做更多的DNA測序

4、反應。橋式橋式PCRPCR二代測序（二代測序（NGSNGS）邊合成邊測序（邊合成邊測序（SBSSBS）FlowcellSBSSBS技術特點技術特點 讀長最初的時候只有31bp，現已能達到600bp。運行時間長，熒光信號會逐漸減弱。每次只能結合1個堿基，發出一種熒光信號。Hiseq 2500可同時運行2張8通道flowcell有高通量模式和快速模式2種模式。單次運行數據量高達500GB?？焖倌Ｊ阶疃踢\行時間17小時。常見醫學領域NGS方案二代測序應用醫療的可行性二代測序應用醫療的可行性NGSNGS的優勢的優勢 相比于一代測序，NGS更加省時低成本，速度快，覆蓋度深，準確度高；高通量測序人類基因組

5、有助于發現與疾病相關的未知基因；對于疾病引起的基因突變，高通量測序可以為患者醫師提供更為準確的診斷依據；需求樣本類型廣泛，樣本量需求少。常見醫學領域常見醫學領域NGSNGS方案方案全基因組重測序（WGRS）尋找個體突變，InDel，CNV，SV等等，需求數據量大，單個樣本需求90G數據。全外顯子組測序（WES）捕獲基因組中的全外顯子進行測序，測序數據量較WGRS少很多，并能獲得高測序深度（50X-150X）常見醫學領域常見醫學領域NGSNGS方案方案靶向區域測序（Target Sequencing）捕獲富集感興趣的靶向區域進行測序，技術流程與全外顯子捕獲相似，測序需求量較WES少，能獲得更高測

6、序深度（最高500X）轉錄組測序（RNA-Seq）研究轉錄水平上的測序，包括mRNA，lncRNA，microRNA等。全基因組重測序是對基因組序列已知的個體進行基因組測序，并在個體或群體水平上進行差異性分析的方法。隨著基因組測序成本的不斷降低，人類疾病的致病突變研究由外顯子區域擴大到全基因組范圍。通過構建不同長度的插入片段文庫和短序列、雙末端測序相結合的策略進行高通量測序，實現在全基因組水平上檢測疾病關聯的常見、低頻、甚至是罕見的突變位點，以及結構變異等，具有重大的科研和產業價值。全基因組重測序全基因組重測序(WGRS/DNA-Seq)(WGRS/DNA-Seq)SNP（個體間差異）CNV（

7、大片段基因拷貝數變異）InDelSV（結構變異）全基因組重測序的應用全基因組重測序的應用SNP(SNV)示例示例為何研究為何研究SNPSNP？SNP目前已被公認為疾病發生的基因分子標記。SNP被認為是導致藥物差異化的主要因素之一，因此可以根據SNP的變化來進行個性化用藥。SNP分布廣泛，且較為穩定。某些SNP會直接影響功能基因表達。大多數的大多數的SNPSNP都是無用的都是無用的 大多數的SNP屬于沉默突變。非編碼區的錯義突變也不會導致蛋白質發生改變。但也有例外但也有例外診斷實例：診斷實例：Dr.James Gern和Joseph DeRisi合作，用MiSeqDx從一個病危的十幾歲的男孩的腦

8、脊液中抽提出核酸樣本，測了8百萬條核酸序列，從中檢出了475條鉤端螺旋體的序列，從而判定這個男孩的病是因為鉤端螺旋體感染。Dr.James Gern依據上述的判斷，給男孩青霉素治療，治好了這個男孩的病。腦脊液是較難取得的體液，只能是采集很少的量，這就限制了所能得到的核酸總量。鉤端螺旋體，在病原體的常見程度排名中是較靠后的種類。在本案例中，如果用PCR方法，挨個排查病原體，可能還沒排到鉤端螺旋體，核酸就不夠了。但高通量測序克服了核酸量不夠的問題。在本案例中，鉤端螺旋體DNA只占總DNA的萬分之0.6，含量極微，但經過高通量測序，得到了475條鉤端螺旋體的DNA，這讓鉤端螺旋體無處循形。2009年

9、H1N1病毒爆發感染時，有一名病人死于呼吸系統引起的多器官衰竭，然而并不知道具體的死因?？茖W家把病人的肺部穿刺組織的DNA拿來做高通量測序。最終在950萬條序列中，含有0.85%的序列來自于H1N1病毒基因組，從而幫助科學家發現了該病人的真正死因。在這樣高人類基因組干擾的背景下，目前其他技術都難以快速發現致病病毒序列、以及分子分型。Kuroda,M.,Katano,H.,Nakajima,N.,Tobiume,M.,Ainai,A.,Sekizuka,T.,Sata,T.(2010).PloS One,5Nimblegen (Roche)SureSelect(Agilent)RNA Oligo

10、Trusight (Illumina)全外顯子測序（全外顯子測序（WESWES）癌癥相關（人）遺傳性疾?。ㄈ耍┢渌莻魅拘约膊。ㄈ耍┲饕糜趯ふ液币娡蛔?，遺傳性突變及癌癥相關的體細胞突變 可以做SNP，InDel分析，但由于捕獲區域較短，一般不用于CNV，SV分析。WES應用領域 成本低（一般50-150X，也僅需要8-15G數據）降低分析背景，容易發現稀有突變。大約能測到50-80bp的片段缺失，由于外顯子捕獲芯片片段較短，很難判斷是由捕獲脫靶導致還是由缺失導致。同樣因為捕獲芯片片段較短，一般不做CNV，SV分析。WES特點WES方案流程 包括mRNA-Seq，lncRNA-Seq，sRNA

11、-Seq等?？梢愿咄糠治鲛D錄本信息，發現未知的轉錄本和基因注釋。尋找個體間，同一個體不同時期等感興趣基因表達豐度變化。轉錄組測序(RNA-Seq)mRNA-Seq方案有關有關lncRNA的一些知識：的一些知識：長度大于200bp無法編碼蛋白有內含子區和外顯子區非編碼RNA具有調節基因表達的作用，如對染色體結構的影響，對RNA加工修飾及穩定性的影響，對轉錄和翻譯的影響，甚至對蛋白質的轉運及穩定性都有一定的影響。所以近年來，許多通過RNA-seq進行測序分析的文章都包括對lncRNA的分析，并且發現了許多新的lncRNA。lncRNA-SeqsRNA-SeqRNA-seq的優勢 不局限于已知的基

12、因組序列信息，適用于未知基因組序列的物種的高通量轉錄組研究 相對于芯片技術，背景信號值低，沒有檢測上限，對于基因表達譜有非常寬的檢測范圍。在有內參的情況下，在定量方面顯示出了較高的準確度和可重復性。不需要克隆的步驟，操作簡單，需要的樣本量少，可在單細胞的水平上進行表達譜分析 通量高，成本比Tilling array或者大規模的EST測序要低。RNA-seq的挑戰 文庫構建過程中大片段的RNA必須經過片段化處理，會引入一定的偏倚。PCR會造成表達量的變化。海量短序列數據的比對或拼接情況復雜，對重復序列和多匹配序列的精確定位存在明顯問題。高等真核生物可變剪接和反式剪接的鑒定仍有相當的誤差。測序深度

13、的確定因物種、器官、組織、時期而變，很難有統一公式直接計算。石蠟包埋樣本解決方案FFPEFFPE樣本樣本(石蠟包埋切片組石蠟包埋切片組織織)石蠟包埋技術（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded,FFPE）是現今臨床上最常見的保存DNA方法，全球醫院的珍貴臨床樣本中超過80%都使用該技術保存，但由于該技術DNA經過福爾馬林浸泡，使DNA分子發生交聯和酶修飾，導致DNA存在不同幅度的降解。樣本量巨大，80%以上的臨床樣本都使用石蠟包埋保存 很多珍貴的臨床樣本已經做過組織學，病理學研究，很容易完成相關實驗驗證為何要使用為何要使用FFPEFFPE樣本樣本 難于抽提，福

14、爾馬林處理后的DNA容易產生交聯，使提取出的DNA量偏低 提取出的DNA質量低，通常降解200bp-5kb 降解程度與石蠟包埋的時間相關FFPE-WESFFPE-WES的巨大挑戰的巨大挑戰是否有相同突變是否有相同突變?目前無法用于WGRS，樣本降解嚴重，對DNA覆蓋度有很大影響。DNA量過少，質量很差。石蠟包埋時間越長，福爾馬林對DNA交聯和損傷就越大。未使用保護緩沖液處理的福爾馬林影響更大。FFPE樣本仍存在問題CTCS和ctDNA什么是什么是CTCsCTCs？CTCs(Circulating Tumor Cells)自發或因診療操作由實體瘤或轉移灶釋放進入外周血循環的腫瘤細胞.CTCs是腫

15、瘤轉移過程中在血液循環系統中存活的腫瘤細胞，它的生成被認為是腫瘤發生轉移的必要前提。CTCsCTCs研究意義研究意義深入研究CTCs有助于對腫瘤轉移機制進一步了解，為抗腫瘤轉移的治療提供新的依據 CTCs的檢測有助于早期轉移腫瘤患者的診斷、監測術后患者腫瘤的復發與轉移有助于評估抗腫瘤藥物的敏感性與患者預后以及選擇個體化的治療策略CTCsCTCs研究難點研究難點CTCs并沒有顯著的特異性同其它血細胞明確區分且不同組織學類型和分子表型的腫瘤分別表達不同的標志物。CTCs在外周血中數量稀少，一般在106-107個白細胞中僅含有1個。無顯著特異性數量少CTCsCTCs的富集的富集非特異性富集方法特異性

16、富集方法方法CTCs-芯片富集法納米粒富集法免疫磁珠富集法密度梯度離心富集法細胞大小 富集法細胞變形性富集法細胞電學特征富集法Ficoll法和Oncoquick法上皮腫瘤細胞大小分離(ISET)和微濾芯片技術雙向電泳-場流分離法（DEP-FFF）磁性活細胞分選法(MACS)、AdnaTest法、Cellsearch法通過細胞形態富集通過細胞形態富集微流芯片微流芯片密度梯度離心密度梯度離心Plasma:血漿血漿Mononuclear cell：單核細胞：單核細胞（包括淋巴細胞、（包括淋巴細胞、單核細胞、單核細胞、上皮細胞和腫瘤細胞）上皮細胞和腫瘤細胞）Ficoll：密度梯度液：密度梯度液RBCs

17、：紅細胞：紅細胞免疫磁珠富集法免疫磁珠富集法微流體微流體CTCsCTCs鑒定鑒定流式細胞儀分析(flow cytometry FCM)免疫細胞化學技術 ICC（immunocytochemistry）鑒定標本中細胞抗原性和形態學特征，能使富集的目的細胞維持細胞形態并保持細胞活力 ICC是用能與顯色劑結合的單抗與 CTCs特異性結合后，通過顯色劑顯色從而對CTCs進行鑒定的技術通過分析上皮細胞或腫瘤細胞的正常起源組織特異的候選基因的表達來檢測 CTC,靈敏度非常高但是壞死的癌細胞、上皮細胞污染等都可以造成假陽性結果，此法無法檢測CTCs細胞形態，在臨床應用上有局限性。反轉錄-聚合酶鏈反應RT-P

18、CRCTCsCTCs與與NGSNGS的結合的結合 捕獲CTCs 鑒定CTCs 單細胞擴增 微量DNA建庫 WES或靶向區域捕獲 高通量測序 生物信息分析ctDNActDNA ctDNA屬于cfDNA中的一種。所謂cfDNA（cell freeDNA）血漿游離DNA，是細胞在代謝過程中釋放到循環系統中的DNA，它們有的來自于正常細胞，有的來自于異常細胞（如腫瘤細胞），還有部分來自于我們外部（如病毒DNA）。ctDNActDNA與與NGSNGS的結合的結合CTCsCTCs與與ctDNActDNA分析比較分析比較CTCsctDNA儀器需求需特殊儀器無需特殊儀器，只需全血樣本分離需特殊儀器分離無需特殊儀器，只需提取cfDNAWGA分析可做不可做檢測精度高高深度測序下才可達到較高精度有創/無創無創無創是否可做組織特異性可以不可，任何細胞都會代謝產生cfDNA謝謝！