乙肝丙肝核酸檢測的新平臺(臨床)

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1、乙肝丙肝核酸檢測的新平臺乙肝丙肝核酸檢測的新平臺 COBASCOBAS AmpliPrep/COBAS TaqManAmpliPrep/COBAS TaqMan 全自動熒光定量分子診斷系統全自動熒光定量分子診斷系統顧顧 劍劍羅氏分子診斷羅氏分子診斷 自動化程度 1992 1996 1998 2001 2003 2006 MWPCOBASAMPLICOR COBAS AMPLIPREP COBASAMPLICORMONITOR羅氏分子診斷羅氏分子診斷標準化標準化自動化自動化重復性重復性COBAS TAQMAN 48COBAS TAQMAN 96一直以來，羅氏分子診斷對臨床一直以來，羅氏分子診斷對

2、臨床核酸檢測市場提供完善可靠和創核酸檢測市場提供完善可靠和創新性的產品及解決方案新性的產品及解決方案目前乙肝和丙肝臨床治療過程中遇到的主要問題目前乙肝和丙肝臨床治療過程中遇到的主要問題 治療終點無法準確判定 有些病人經一段時間治療后DNA/RNA檢測結果忽陰忽陽，但臨床癥狀依然明顯 不能及時預測耐藥（病毒學突破）核苷（酸）類似物治療后病毒DNA/RNA快速下降至檢測限以下，不久卻發現病毒出現反跳 療效的準確監測？治療后12或24周病毒DNA/RNA下降幅度直接決定預后問題的根源在哪里？問題的根源在哪里？內內 容容 HBV核酸檢測的現狀與需要核酸檢測的現狀與需要 HCV核酸檢測的現狀與需要 羅氏

3、的CAP/CTM能帶來什么益處 總結HBV DNAHBV DNA監測在抗病毒治療中的臨床應用監測在抗病毒治療中的臨床應用 HBV DNA是監測抗病毒治療監測抗病毒治療響應和時間的關鍵標志物 HBV 治療的路線圖理念，為HBV DNA監測用于臨床實踐提供了指導 對用藥耐藥性的監測用藥耐藥性的監測（拉米夫定YMDD，）肝移植HBV復發風險的降低（術前，術后）HBV DNA監測監測的的臨臨床床應應用用HBV治治療療路路線圖線圖 Keeffe E.Clin Gastro Hepatology 2007;5:890-897.侯金林等，慢性乙型肝炎抗病毒治侯金林等，慢性乙型肝炎抗病毒治療療方案方案優優化，

4、中國肝化，中國肝臟臟病病雜雜志志國產試劑現狀國產試劑現狀 目前使用的國產試劑能解決的問題，不能解決的問題：HBV試劑盒說明：5005107 IU/mL 較可信的測試范圍：1045107 IU/mL 對部分發生HBV病毒突變的病人無法準確檢測注：注：1 IU/mL=1 copy/mL1 IU/mL=1 copy/mL內內 容容 HBV核酸檢測的現狀與需要 HCV核酸檢測的現狀與需要核酸檢測的現狀與需要 羅氏的CAP/CTM能帶來什么益處 總結HCV DNAHCV DNA監測在抗病毒治療中的臨床應用監測在抗病毒治療中的臨床應用 HCV病毒感染是可治愈的疾病 HCV RNA檢測可以有效指導臨床用藥

5、治療的終點治療的終點是核酸檢測為陰性（核酸檢測可以直接指導停藥時機）慢性慢性HCVHCV治療方案治療方案治療應答名稱治療應答名稱描述描述快速病毒學應答（快速病毒學應答（RVR）4周時未檢測到HCV RNA早期病毒學應答（早期病毒學應答（EVR）-完全早期病毒學應答完全早期病毒學應答（cEVR）未RVR，但12周時未檢測到HCV RNA-部分早期病毒學應答部分早期病毒學應答（pEVR）未RVR，12周時HCV RNA拷貝數下降2log10，但仍檢測到HCV RNA沒有應答沒有應答12周時HCV RNA拷貝數下降2log10治療結束（治療結束（EOT）治療結束未檢測未檢測到HCV RNA持續病毒學

6、應答（持續病毒學應答（SVR）治療結束后24周，未檢測到HCV RNA反彈反彈治療期間曾有HCV RNA低于檢出限，但尚未停藥即出現HCV RNA重新升高復發復發治療期間HCV RNA低于檢出限，但治療結束（停藥）后HCV RNA重新升高慢性慢性HCVHCV治療方案治療方案用藥用藥12周早期病毒學反應周早期病毒學反應HCV RNA下降下降2log繼續治療至繼續治療至48周周繼續治療至繼續治療至24周周考慮停藥考慮停藥國產試劑現狀國產試劑現狀 目前使用的國產試劑能解決的問題，不能解決的問題：HCV試劑盒說明：5005107 IU/mL 較可信的測試范圍：1045107 IU/mL注：1 IU/m

7、L=1 copy/mL內內 容容 HBV核酸檢測的現狀與需要 HCV核酸檢測的現狀與需要 羅氏的羅氏的CAP/CTM能帶來什么益處能帶來什么益處 總結全世界第一臺用于體外診斷的全自動熒光定量分子診斷系統全世界第一臺用于體外診斷的全自動熒光定量分子診斷系統真正實現真正實現“樣品進，結果出樣品進，結果出”全球安裝超過全球安裝超過 2,000臺，國內安裝超過臺，國內安裝超過 40臺臺COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 系統系統COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan48系統COBAS AmpliPrep/

8、COBAS TaqMan 96系統（帶連接系統）COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 96系統（無連接系統）COBAS AmpliPrepCOBAS AmpliPrep儀器簡介儀器簡介全自動系統，自動進行核酸提取純化和PCR反應體系配制 基于MGPMGP磁珠磁珠分離技術，確保高質量的核酸提取純化最多72個樣品可以同時上機，運行中可連續裝載上架，提高工作效率 包括耗材、樣品、試劑均可以連續上樣DNA或者RNA1.裂解、穩定和去蛋白裂解、穩定和去蛋白2.核酸捕獲核酸捕獲病毒或細胞3.沖洗沖洗4.洗脫洗脫37C孵育孵育COBAS AmpliPrepCOBAS AmpliPrep儀

9、器儀器MGP MGP 磁珠分離技術磁珠分離技術室溫室溫80C孵育孵育取SPU槍頭樣本管/反應管管蓋抓手樣本初始體積感應器取試劑鋼針CAPCAP機械臂介紹機械臂介紹樣本管/反應管結構COBASCOBAS TaqMan/COBAS TaqMan 48TaqMan/COBAS TaqMan 48分析儀簡介分析儀簡介檢測通量可達4*24測試獨立的24孔熱循環儀 TaqMan 48有2個模塊，TaqMan 96有4個模塊 最多可同時進行4個不同的分析檢測 操作簡單，核酸擴增和檢測全部自動完成實時定量PCR檢測技術，卓越的檢測性能，靈敏度高和特異性好，動態范圍寬HBV-DNAHBV-DNA定量測試定量測試

10、用于藥品用于藥品FDAFDA注冊試驗注冊試驗通用名商品名 FDA批準日期關鍵的HBV-DNA測試Interferon alfa-2b-2b 干擾素 INTRON A1991N/ALamivudine拉米夫定EPIVIR-HBV1998雜交研究解決方案 1Adefovir dipivoxil阿德福韋酯 HEPSERA2002Amplicor Monitor 2Entecavir恩替卡韋BARACLUDE2005Cobas Amplicor 3Peginterferon alfa-2a聚乙二醇干擾素-2aPEGASYS2005Cobas Amplicor 4Telbivudine替比夫定TYZEK

11、A2006Cobas Amplicor 5Tenofovir替諾福韋VIREAD(HIV)Phase 3Cobas TaqMan 6 (Lamivudine)package insert GlaxoSmithKline,Research Triangle park,NC 3.(Adefovir dipivoxil)package insert Gilead Sciences.Foster City,CA Pegasys(Peginterferon alfa-2a)package insert.Hoffmann-La Roche Inc.Nutley,NJ 5.Abstract 63,Dec 9

12、-13 2007,Lahaina,HI國外發表的文獻國外發表的文獻Evaluation of initial virological response to adefovir and development of adefovir-resistant mutations in patients with chronic hepatitis B.Gallego et al.,Journal of Viral Hepatitis,2008,15,392398Evaluation of an automated,highly sensitive,real-time PCR-based assay(C

13、OBAS AmpliprepTM/COBAS TaqManTM)for quantification of HCV RNA.Christoph Sarrazina et al.,Journal of Clinical Virology,2008,43,162168COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan Hepatitis B Virus(HBV)Test:a Novel Automated Real-Time PCR Assay for Quantification of HBV DNA in Plasma.Tiziano Allice et al.,Journal of C

14、linical Microbiology,Mar.2007,p.828834Evaluation of the COBAS AmpliPrep-total nucleic acid solation-COBAS TaqMan hepatitis B virus(HBV)quantitative test and comparison to the VERSANT HBV DNA 3.0 assay.Ronsin C et al.,Journal of Clinical Microbiology 2006 vol.44(no.4)Comparison of the COBAS TaqManTM

15、HBV Test With the COBAS Amplicor MonitorTM Test for Measurement of Hepatitis B Virus DNA in Serum.Simon Siu-Man Sum et al.,Journal of Medical Virology 2005,77:486490Hepatitis B virus(HBV)genotype determination by the COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test,v2.0 in serum and plasma matrices.Goedel S et

16、 al.,Journal of Clinical Virology 2009 Jul;45(3):232-6Comparison of Versant HBV DNA 3.0 and COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan assays for hepatitis B DNA quantitation:Possible clinical implications.GARBUGLIA A.R.et al.,Journal of virological methods 2007,vol.146,no1-2,pp.274-280 Performance of the Cobas A

17、mpliPrep/Cobas TaqMan Real-Time PCR Assay for Hepatitis B Virus DNA Quantification.Stephane Chevaliez et al.,Journal of Clinical,May 2008,p.17161723HBVHBV的定量檢測性能指標的定量檢測性能指標國產國產HBVHBV試劑試劑CAP/CTM HBVCAP/CTM HBV靈敏度靈敏度 (LOD)(LOD)500 IU/mL？12 IU/mL12 IU/mL檢測范圍檢測范圍1045107 IU/mL54 54-1.1-1.110108 8 IU/mL I

18、U/mL定量方法定量方法外標法定量內標法定量內標法定量其它其它對部分發生HBV病毒突變的病人無法準確檢測涵蓋亞型:A-G加強加強pre-corepre-core突變檢測突變檢測注：注：國產試劑國產試劑1 IU/mL=1 copy/mLHCVHCV的定量檢測性能指標的定量檢測性能指標國產國產HCVHCV試劑試劑CAP/CTM HCVCAP/CTM HCV靈敏度靈敏度 (LOD)(LOD)500 IU/mL？15 IU/mL15 IU/mL檢測范圍檢測范圍1045107 IU/mL43 43 6.9 6.910107 7 IU/mL IU/mL定量方法定量方法外標法定量內標法定量內標法定量其它其它

19、未知1-6 型(能區分 0.5 log濃度變化)定量原理定量原理外標法定量（國產試劑）外標法定量（國產試劑）使用一組（4管）外部標準品定量，分別為5 510104 4到5107 IU/mL未考慮各患者血液成分間的差異性各患者血液成分間的差異性對結果的影響定量原理定量原理內標定量內標定量Internal Quantitation StandardInternal Quantitation Standard(CAP/CTM)(CAP/CTM)內標是已知拷貝數的人工構建核酸，加入每一反應管，與靶核酸競爭擴增，管內定量可提示反應是否存在反應抑制，避免假陰性結果避免假陰性結果充分考慮管間反應效率的差異充

20、分考慮管間反應效率的差異，得到可靠精確的結果 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqManCOBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan系統系統封閉樣品管輸入，封閉封閉樣品管輸入，封閉PCRPCR管輸出管輸出 標準化，標準化，重復性重復性純化好純化好的核酸的核酸主反應液主反應液PCRPCR反應體系的配制反應體系的配制試劑、樣品和耗材的裝載上機試劑、樣品和耗材的裝載上機樣品處理單元K-槍頭K-管樣品試劑BranchburgBranchburg生產廠房生產廠房羅氏投資超過億美金，建成全球最大分子診斷試劑生產基地羅氏投資超過億美金，建成全球最大分子診斷試劑生產基地目前每月生產目

21、前每月生產1414萬套試劑萬套試劑羅氏分子診斷嚴格的生產和質控體系羅氏分子診斷嚴格的生產和質控體系為整個行業設定了高標準為整個行業設定了高標準1.原料嚴格把關3.GMP生產2.原料質檢4.GMP生產6.成品質檢5.試劑盒成品7.資料入檔COBAS AmpliPrep/COBAS TaqManCOBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan全自動熒光定量分子診斷系統的應用全自動熒光定量分子診斷系統的應用 抗病毒治療評估和監測（抗病毒治療評估和監測（HBV/HCVHBV/HCV），為臨床醫生和病人提高更準確的結果，指導用藥?？舍槍σ呻y病例、低病毒載量、長期用藥或高端病人 肝移植肝移植的術前

22、術后監控 全國藥物、診斷試劑臨床評估臨床評估實驗基地 CAP室間質評時有與國際接軌與國際接軌的平臺，評價更科學 基礎研究基礎研究的工具，文章可信度大大增加國內部分用戶國內部分用戶省份省份用戶用戶主要檢測項目主要檢測項目儀器類型儀器類型北京北京大學人民醫院肝炎所（魏來）HBV/HCVCAP/CTM 48北京北京大學基礎醫學院（莊輝）HBV/HCVCAP/CTM 48北京北京友誼醫院（賈繼東）HBV/HCVCAP/CTM 48浙江浙江大學附屬第一醫院（李蘭娟）HBV/HCVCAP/CTM 48廣東南方醫院（侯金林）HBV/HCVCAP/CTM 96北京北京大學第一醫院HBV/HCVCAP/CTM

23、48北京北京協和醫院HBV/HCV/HIVCAP/CTM 48上海上海瑞金醫院（張欣欣）HBV/HCVCAP/CTM 48四川華西醫科大學附屬華西醫院（唐紅）HBV/HCVCAP/CTM 96湖北武漢同濟醫院HBV/HCVCAP/CTM 48廣東廣州第八人民醫院HBV/HCV/HIVCAP/CTM 48上海上海公共衛生中心HBV/HCV/HIVCAP/CTM 48重慶西南醫院(毛青)(裝機中)HBV/HCVCAP/CTM 48重慶重醫大附二院(任紅，張大志)(裝機中)HBV/HCVCAP/CTM 48國內用戶現已超過40家 國內國內HBVHBV核酸檢測實例核酸檢測實例 共檢測21份國產試劑HB

24、V均為陰性的標本 其中CAP/CTM HBV仍為陰性者共9份，CAP/CTM HBV為陽性者共12份。陽性率57.1%1份國產試劑陰性樣本，CAP/CTM HBV檢測達到106 IU/mL。估計因耐藥產生HBV病毒突變致使國產試劑無法檢測 CAP/CTM HBV在國產試劑陰性樣本中的陽性表血清學指標特征血清學指標特征構成比（構成比（CAP/CTM HBV陽性陽性/國產試劑國產試劑HBV陰性）陰性）HBsAg+,HBeAb+,HBcAb+(小三陽)8/13HBsAg+,HBeAg+,HBcAb+(大三陽)2/3HBsAg+,HBcAb+1/1HBsAg+,HBeAg+,HBcAb+,HBeAb+1/1HBsAb+,HBcAb+0/2HBsAb+,HBcAb+,HBeAb+0/1總總 結結COBAS AmpliPrep/COBAS TaqManCOBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan全自動熒光定量分子診斷系統的特點全自動熒光定量分子診斷系統的特點 國際金標準國際金標準 靈敏度和重復性明顯優于國產試劑，對抗病毒治療重要靈敏度和重復性明顯優于國產試劑，對抗病毒治療重要 唯一內標定量，結果精準唯一內標定量，結果精準 全自動全封閉體系，保證結果的重現性全自動全封閉體系，保證結果的重現性We Innovate Healthcare