肺炎鏈球菌的分離和鑒定

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1、衛生部北京醫院衛生部北京醫院陳東科陳東科 肺炎鏈球菌肺炎鏈球菌（S.pneumoniae），俗稱肺炎球菌（pneumococcus）。經常寄居于正常人的鼻咽腔中，一般不致病，只形成帶菌狀態。當機體免疫力下降時才致病。尤其在呼吸道病毒感染后或嬰幼兒、老年體弱者易發生肺炎鏈球菌性肺部感染。肺炎鏈球菌不產生外毒素，主要靠莢膜侵襲力致病。肺炎鏈球菌主要引起人類大葉性肺炎，肺炎后可繼發胸膜炎、膿胸，也可引起中耳炎、乳突炎、副鼻竇炎、支氣管炎、心內膜炎、腹膜炎、關節炎、腦膜炎和敗血癥等。細菌學檢驗不僅對疾病的病原學診斷有重要價值，同時對臨床治療的藥物選擇也具有十分重要意義。一、生物學性狀一、生物學性狀l肺

2、炎鏈球菌革蘭染色呈陽性。球形或矛頭狀，成雙排列，少呈鏈狀。在組織中可形成莢膜（人工培養莢膜逐漸消失），無鞭毛及芽孢。l（1）培養基培養基l肺炎鏈球菌對營養要求較高，需采用質量好的哥倫比亞瓊脂基礎和新鮮血液（5馬血或羊血）。l瓊脂濃度可適當下降至11.2，有利于肺炎鏈球菌的生長。1）標本處理）標本處理 及時將采集標本接種到適當的培養基上是提高分離率的前提。因為，肺炎鏈球菌對干燥、對寒冷的抵抗力均較弱，在標本離開機體暴露于外界復雜的環境中，其存活率十分低，不及時接種適當培養基是導致分離率低的主要原因。l培養基中添加5g/ml慶大霉素有利于肺炎鏈球菌的分離。510CO2、35培養2448h。l在營養

3、豐富的培養基上，肺炎鏈球菌形成扁平、中間有凹陷的典型菌落，少數菌可呈粘液型菌落。（1）種屬特異性抗原：）種屬特異性抗原：為菌體多糖抗原，存在于肺炎鏈球菌的細胞壁。（2）型特異性抗原：）型特異性抗原：是存在于肺炎鏈球菌莢膜中的一種多糖多聚體，可溶于水，據此抗原可將肺炎鏈球菌分為、等個型，其中、型致病性最強。（3）菌體核蛋白抗原：）菌體核蛋白抗原：存在于菌體深部，為蛋白質，無特異性。l肺炎鏈球菌的鑒定，主要應與甲型溶血性鏈球菌鑒別。其中以膽汁溶菌試驗、菊糖發酵和optochin試驗最為常用。必要時可作小鼠毒力試驗加以鑒別。在上述試驗中，肺炎鏈球菌均應陽性，而甲型溶血性鏈球菌為陰性。必要時可用特異性

4、單克隆乳膠或自動化儀器等相應鑒定卡作鑒定。l 革 蘭 陽 性 雙 球 菌，矛 頭 狀，不 呈 鏈；l 血 平 皿 菌 落 呈 草 綠 溶 血，濕 潤，菌 落 表 面 無 小 白 點；l 培 養 時 間 長 出 現 臍 窩 狀；l膽汁溶解試驗陽性；l 乳 膠 單 克 隆 抗 體 凝 集 陽 性。l肺炎鏈球菌在厭氧或二氧化碳環境中溶血能力大大加強，草綠色溶血環很大，可與其他草綠色鏈球菌相區別。optochin即乙基氫化叩卟啉，因結構似于奎寧，故又稱為乙基氫化羥基奎寧。該藥對肺炎鏈球菌的作用機制是干擾其葉酸的合成。optochin敏感試驗方法似藥敏試驗。挑取被檢菌，密涂于血平板上，貼上含5g/片的o

5、ptochin紙片，置510%CO2的大氣中（或燭缸），35孵育過夜。抑菌環直徑=14mm為敏感，推斷為肺炎鏈球菌。抑菌環直徑=14mm。應注意鑒別。l但大多數肺炎鏈球菌對苯唑西林（Oxacillin,OX）是敏感的(除外PRP)，而緩癥鏈球菌和口腔鏈球菌對OX耐藥。這可作為輔助鑒別點。自溶酶自溶酶是一種L-丙氨酸-N-乙酰胞壁酰胺酶，能切斷肽聚糖上L-丙氨酸與N-乙酰胞壁酸間的連接鍵，從而破壞細胞壁，使菌溶解。自溶酶在菌生長的穩定期被激活，也可被膽汁或膽鹽等活性物質激活，從而促進培養物中的菌體溶解。肺炎鏈球菌膽汁溶菌試驗為陽性，甲型溶血性鏈球菌的膽汁溶菌試驗為陰性。（1）試管法:取新鮮培養物

6、分裝于兩支試管內（每支1ml），其中一支加入10%的去氧膽酸鈉溶液0.1ml或純牛膽汁0.2ml，另一支加入無菌鹽水兩滴（對照），15min后，陽性者細菌被溶解，試管內液體呈透明狀，陰性者無變化。（2）平皿法）平皿法:加一滴10%的去氧膽酸鈉溶液或純牛膽汁于被檢菌菌苔上，15min后，陽性者細菌菌苔被溶解，陰性者無變化。試驗應有已知肺炎鏈球菌作陽性對照。結果準確、快速、特異性高。l 取一滴抗血清與一滴菌懸液混勻，加少量美藍液混合后加蓋片，室溫1020min后，用油鏡檢查，如查到菌體呈蘭色，周圍繞有界限明顯未染色的膨大空白圈為陽性?？捎糜诜窝祖溓蚓姆中?。l 包括血清凝集試驗、SPA（葡萄球菌蛋

7、白A）協同凝集試驗、反向乳膠凝集試驗等方法。ll菌 種 Optochin 膽汁 膽 汁 6.5%NaCl 吡咯烷 衛星現象 CAMP 血清群l 敏 感 溶菌 七葉苷 肉湯 酮 酶ll肺炎鏈球菌 +l牛鏈球菌 +Dl無乳鏈球菌 d +Bl草綠色鏈球菌 l營養變異鏈球菌 +ll*d.不同菌株lK-B法：法：采用Mueller-Hinton瓊脂5羊血培養基。直接菌落懸液法(0.5麥氏單位菌液，在15分鐘內接種完)作為接種液。l稀釋法：稀釋法：包括瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法和Etest法。l培養條件：培養條件：為35、5CO2培養2024小時。質控菌株ATCC 49619。l青霉素青霉素G耐藥肺炎鏈球菌耐

8、藥肺炎鏈球菌（PRP）的耐藥機制是肺炎鏈球菌有6種青霉素結合蛋白（PBP）發生改變，因為PBP1a/1b和PBP2a/2x/2b是-內酰胺類抗生素的作用靶位，改變后使PBP與青霉素G的結合力下降；l青霉素G耐藥肺炎鏈球菌（PRP）始發現于1967年；l多重耐藥多重耐藥肺炎鏈球菌（MDR）1977年首次在南非爆發流行。l肺炎鏈球菌對奎諾酮類奎諾酮類抗生素的耐藥主要是由該菌產生拓撲酶所致。l肺炎鏈球菌對大環內酯類大環內酯類抗生素的耐藥機制主要為靶位的改變，即核糖體50S亞單位改變所致，由ersB(erythromycin resistance methylase)基因介導，其耐藥表型為MLS，即對

9、大環內酯類、林可酰胺類和鏈陽霉素B交叉耐藥。另一耐藥機制為主動外排系統，由mefA基因介導，其耐藥表型為M，即對14元環（紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素、地紅霉素、氟紅霉素）、15元環（阿奇霉素）大環內酯類低水平耐藥，而對16元環大環內酯類（羅他霉素、柱晶白霉素、交沙霉素、麥迪霉素、麥白霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素、米歐卡霉素）、林可霉素和鏈陽霉素B敏感。l耐青霉素肺炎鏈球菌的傳播主要有兩種途徑耐青霉素肺炎鏈球菌的傳播主要有兩種途徑:l(1)克隆傳播，是耐藥菌株從一個國家或地區傳播到另一個國家或地區。l(2)基因水平轉移，是把耐藥基因轉移到敏感菌株中。l過度使用抗生素是耐藥菌株傳播的危險因素。一般

10、認為在抗生素的壓力選擇下，敏感菌株被殺死，耐藥菌株確能生存下來,或者其他相關鏈球菌耐藥的DNA序列通過基因轉移在肺炎鏈球菌之間傳播。l研究發現證實兒童鼻咽部存在“隱匿性耐藥克隆株隱匿性耐藥克隆株”。l隨著我國兒童-內酰胺類抗生素大量使用,可以預計不久的將來,不敏感的肺炎鏈球菌將會急劇增加。l 紙片擴散法對內酰胺類藥物結果的準確性不夠，用1g/片苯唑西林(OX)篩選肺炎鏈球菌對青霉素耐藥時，當抑菌環直徑小于20mm時，就必須做稀釋法證實是耐藥。l用1ug/片苯唑西林紙片測試青霉素敏感性，當抑菌環20mm或MIC0.06ug/ml可報告青霉素敏感。并同時可報告氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸

11、、頭孢克羅、頭孢地尼、頭孢吡肟、頭孢他美、頭孢克肟、頭孢噻肟、頭孢丙烯、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢泊肟、頭孢唑肟、亞胺培南、氯碳頭孢和美羅培南敏感而不需要再測定這些藥的敏感性。l當苯唑西林抑菌圈19mm時應確定青霉素、頭孢噻肟或頭孢曲松的MICs，因為抑菌環19mm可以發生在青霉素耐藥、中介或敏感菌株中。l當從血液或腦脊液中分離出肺炎鏈球菌，應常規報告MICs。測定的藥物應包括青霉素、頭孢噻肟或頭孢曲松、美羅培南和萬古霉素。l青霉素G敏感均可直接用青霉素G進行治療;l青霉素G中度耐藥株可用大劑量青霉素G進行治療；l如重度耐藥可選用三代頭孢菌素加萬古霉素或利福平進行治療。l1.肺炎鏈球菌寄居于人的上呼吸道中，是條件 致病菌；l2.肺炎鏈球菌對營養要求較高，在含有新鮮血液 的培養基中生長良好；l3.以optochin 試驗和膽汁溶菌試驗將肺炎鏈球菌 與其他溶血鏈球菌相區別；l4.血清學鑒定特異性高；l5.要注意對PRP和MDR的檢測。謝謝！