常用分子生物學技術的原理及應用

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1、常用分子生物學技術的常用分子生物學技術的原理及應用原理及應用The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology分子雜交與印跡技術分子雜交與印跡技術Molecular Hybridization and Blotting Techniquen核酸分子雜交核酸分子雜交(nucleic acid hybridization)在在DNA復性復性過程中，如果把不同過程中，如果把不同DNA單鏈單鏈分子放在同一溶液中，或把分子放在同一溶液中，或把DNA與與RNA放在一放在一起，只要在起，只要在DNA或或RN

2、A的單鏈分子之間有一定的單鏈分子之間有一定的堿基配對關系，就可以在不同的分子之間形的堿基配對關系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈成雜化雙鏈(heteroduplex)。一、分子雜交與印跡技術的原理一、分子雜交與印跡技術的原理復性復性RNADNA（一）印跡技術（一）印跡技術利用各種利用各種物理物理方法使電泳膠中的生物方法使電泳膠中的生物大分子大分子轉移到轉移到NC等各種等各種膜膜上，使之成為上，使之成為固相化分子固相化分子。這一技術類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因這一技術類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為此稱之為“blotting”，譯為印跡技術。，譯為印跡技術。用放射性核素、生物

3、素或熒光染料用放射性核素、生物素或熒光染料標記標記其其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針探針”，探針可以與固定在，探針可以與固定在NC膜上的核苷膜上的核苷酸結合，判斷是否有同源的核酸分子存在。酸結合，判斷是否有同源的核酸分子存在。（二）探針技術（二）探針技術二、印跡技術的類別及應用二、印跡技術的類別及應用（一）（一）DNA印跡印跡(Southern blotting)（二）（二）RNA印跡印跡(Northern blotting)（三）蛋白質的印跡（三）蛋白質的印跡(Western blotting)用于基因組用于基因組DNA、重組質粒和噬菌

4、體的分析。、重組質粒和噬菌體的分析。用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白質定性定量及相互作用研究。用于蛋白質定性定量及相互作用研究。n其他：其他：斑點印跡斑點印跡(dot blotting)原位雜交原位雜交(in situ hybridization)DNA點陣點陣(DNA array)DNA芯片技術芯片技術(DNA chip)三種印跡技術的比較三種印跡技術的比較分子雜交實驗分子雜交實驗放放射射自自顯顯影影照照片片DNA芯片芯片技術技術PCR技術的原理與應用技術的原理與應用The Principle and Application of PCR Technology5 Pri

5、mer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA一、一、PCR技術的工作原理技術的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環后，模板次循環后，模板DNA的含量的含量可以擴大可以擴大100萬倍以上。萬倍以上。PCR技術原理示意圖技術原理示意圖 n PCR的基本反應步驟的基本反應步驟變性變性95C95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C 模板模板DNA 特異性引物特異性引物 耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶 dNTPs Mg2+n PCR體系基本組成成分體系

6、基本組成成分利用特異性引物以利用特異性引物以cDNA或基因組或基因組DNA為模板獲為模板獲得已知目的基因片段得已知目的基因片段,或與逆轉錄反應相結合，直或與逆轉錄反應相結合，直接以組織和細胞的接以組織和細胞的mRNA為模板獲得目的片段；為模板獲得目的片段；利用簡并引物從利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得文庫或基因組文庫中獲得序列相似的基因片段；序列相似的基因片段；利用隨機引物從利用隨機引物從cDNA文庫或基因組文庫中克隆文庫或基因組文庫中克隆基因?；?。二、二、PCR技術技術的主要用途的主要用途（一）目的基因的克?。ㄒ唬┠康幕虻目寺±美肞CR技術可以隨意設計引物在體技術可以隨意

7、設計引物在體外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。變等改造。PCR技術高度敏感，對模板技術高度敏感，對模板DNA的的量要求很低，是量要求很低，是DNA和和RNA微量分析的微量分析的最好方法。最好方法。（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（二）基因突變（二）基因突變將將PCR技術引入技術引入DNA序列測定，使測序序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度；工作大為簡化，也提高了測序的速度；待測待測DNA片段既可克隆到特定的載體后片段既可克隆到特定的載體后進行序列測定，也可直接測定。進行序列測定，也可直接測定。PCR與其他技術的結合可以

8、大大提高基與其他技術的結合可以大大提高基因突變檢測的敏感性因突變檢測的敏感性。（四）（四）DNA序列測定序列測定（五）基因突變分析（五）基因突變分析 逆轉錄逆轉錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是將是將RNA的逆轉錄反應和的逆轉錄反應和PCR反應聯合反應聯合應用的一種技術。應用的一種技術。RT-PCR是目前從組織或細胞中獲得目的基因是目前從組織或細胞中獲得目的基因以及對已知序列的以及對已知序列的RNA進行定性及半定量分進行定性及半定量分析的最有效方法。析的最有效方法。（一）逆轉錄（一）逆轉錄PCR技術技術三、幾種重要的三、幾種重要的PCR衍生技術衍生技

9、術 原位原位PCR(in situ PCR)是在組織切片或細胞涂片是在組織切片或細胞涂片上的單個細胞內進行的上的單個細胞內進行的PCR反應，然后用特異反應，然后用特異性探針進行原位雜交，即可檢出待測性探針進行原位雜交，即可檢出待測DNA或或RNA是否在該組織或細胞中存在。是否在該組織或細胞中存在。原位原位PCR方法彌補了方法彌補了PCR技術和原位雜交技術技術和原位雜交技術的不足，是將目的基因的擴增與定位相結合的的不足，是將目的基因的擴增與定位相結合的一種最佳方法。一種最佳方法。（二）原位（二）原位PCR技術技術（三）實時（三）實時PCR技術技術實時實時PCR(real-time PCR)技術通

10、過動態技術通過動態監測反應過程中的產物量，消除了產物堆積監測反應過程中的產物量，消除了產物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。n實時實時PCR技術原理技術原理QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物熒光標記引物熒光標記引物RQ 3355n實時實時PCRPCR分類：分類：實時實時PRC非探針類非探針類探針類探針類1.TaqMan1.TaqMan探針法探針法 2.2.分子信標探針法分子信標探針法 3.FRET3.FRET探針法探針法 圖圖20-3 TaqMan探針法實時探針法實時PCR原理示意圖原理示意圖基因文庫基因文庫Gene Library 基因組基因組

11、DNA文庫文庫(genomic DNA library)cDNA文庫文庫(cDNA library)n基因文庫基因文庫(gene library)是指一個包含了某一生物體全部是指一個包含了某一生物體全部DNADNA序列序列的克隆群體。的克隆群體。一、基因組一、基因組DNA文庫文庫基因組基因組DNADNA文庫是指生物的文庫是指生物的基因組基因組DNA的的信息（包括所有的編碼區和非編碼區）以信息（包括所有的編碼區和非編碼區）以DNA片段形式貯存的克隆群體。片段形式貯存的克隆群體。用于構建基因組文庫的載體有用于構建基因組文庫的載體有 噬菌體、噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。粘粒和酵母人工染色體等。n

12、基因組文庫和基因組文庫和cDNA文庫的構建和篩選文庫的構建和篩選第一輪篩選第一輪篩選第二輪篩選第二輪篩選第三輪篩選第三輪篩選n基因組文庫篩選結果舉例基因組文庫篩選結果舉例cDNA文庫是包含某一組織細胞在一定條文庫是包含某一組織細胞在一定條件下所表達的全部件下所表達的全部mRNAmRNA經逆轉錄而合成的經逆轉錄而合成的cDNA序列序列的克隆群體，它以的克隆群體，它以cDNA片段的形片段的形式貯存著該組織細胞的基因表達信息。式貯存著該組織細胞的基因表達信息。二、二、cDNA文庫文庫生物芯片技術生物芯片技術Biological Chip Technique是指將許多特定的是指將許多特定的DNADNA

13、片段有規律地緊密排片段有規律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標記樣品進行雜交，雜交后用熒光檢測系統等光標記樣品進行雜交，雜交后用熒光檢測系統等對芯片進行掃描，通過計算機系統對每一位點的對芯片進行掃描，通過計算機系統對每一位點的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結果。該技術亦被稱作定性和定量的結果。該技術亦被稱作DNA微陣列微陣列(DNA microarray)。一、基因芯片一、基因芯片n基因芯片基因芯片(gene chip)n基因芯片工作流程示意圖基因芯片工作流程示意圖是

14、將高度密集排列的蛋白分子作為探針點是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反應時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經檢測系統應時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經檢測系統對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術。對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術。二、蛋白質芯片二、蛋白質芯片蛋白質分子間的親和反應蛋白質分子間的親和反應n蛋白質芯片蛋白質芯片(protein chip)n蛋白質芯片蛋白質芯片作用原理作用原理生物大分子相互作用研究技術生物大分子相互作用研究技術 The Method of Protein-protein and Protei

15、n-DNA Interaction Study一、蛋白質相互作用研究技術一、蛋白質相互作用研究技術 酵母雙雜交酵母雙雜交 各種親和分析（標簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各種親和分析（標簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉換效應分析熒光共振能量轉換效應分析 噬菌體顯示系統篩選噬菌體顯示系統篩選n常用蛋白質相互作用的研究技術常用蛋白質相互作用的研究技術標簽融合蛋白結合實驗是一個基于親和色譜標簽融合蛋白結合實驗是一個基于親和色譜原理的、分析蛋白質體外直接相互作用的方法。原理的、分析蛋白質體外直接相互作用的方法。（一）標簽蛋白沉淀（一）標簽蛋白沉淀標簽融合蛋白結合實驗主要用于證明兩種蛋標簽融合蛋白結合

16、實驗主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結合、分析兩種分子結白分子是否存在直接物理結合、分析兩種分子結合的具體結構部位及篩選細胞內與融合蛋白相結合的具體結構部位及篩選細胞內與融合蛋白相結合的未知分子。合的未知分子。標簽融合標簽融合蛋白沉淀蛋白沉淀實驗流程實驗流程示意圖示意圖（二）酵母雙雜交技術的基本原理（二）酵母雙雜交技術的基本原理和用途和用途n酵母雙雜交系統的應用酵母雙雜交系統的應用 證明兩種已知基因序列的蛋白質可以相互作用證明兩種已知基因序列的蛋白質可以相互作用的生物信息學推測。的生物信息學推測。分析已知存在相互作用的兩種蛋白質分子的的分析已知存在相互作用的兩種蛋白質分子的的相互作用功

17、能結構域或關鍵的氨基酸殘基。相互作用功能結構域或關鍵的氨基酸殘基。將擬研究的蛋白質的編碼基因與將擬研究的蛋白質的編碼基因與BD基因融合成基因融合成為為“誘餌誘餌”表達質粒，可以篩選表達質粒，可以篩選AD基因融合的基因融合的“獵物獵物”基因表達文庫，篩選未知的相互作用基因表達文庫，篩選未知的相互作用蛋白質。蛋白質。（三）免疫共沉淀技術的基本原理（三）免疫共沉淀技術的基本原理和用途和用途 免疫沉淀（免疫沉淀（immunoprecipitation IP）免疫沉淀是利用抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法。利免疫沉淀是利用抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法。利用抗體可與抗原特異性結合的特性

18、，將抗原（常為靶蛋白）從混合用抗體可與抗原特異性結合的特性，將抗原（常為靶蛋白）從混合體系沉淀下來。體系沉淀下來。免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。相互作用的有效方法。CO-IP與質譜分析與質譜分析 以細胞內源性靶蛋白為誘餌以細胞內源性靶蛋白為誘餌，用抗靶蛋白抗體與細胞總蛋白進行免用抗靶蛋白抗體與細

19、胞總蛋白進行免疫共沉淀純化靶蛋白免疫復合物疫共沉淀純化靶蛋白免疫復合物，凝膠電泳分離后凝膠電泳分離后，質譜鑒定靶蛋質譜鑒定靶蛋白的結合蛋白白的結合蛋白n免疫沉淀原理圖解免疫沉淀原理圖解n免疫共沉淀原理圖解免疫共沉淀原理圖解n免疫共沉淀原理圖解免疫共沉淀原理圖解蛋白蛋白A，蛋白蛋白B 抗抗A抗體抗體C進行洗脫進行洗脫抗抗B抗體抗體D進行驗證進行驗證IP C ACO-IP C A+B DnCO-IPCO-IP與質譜分析流程與質譜分析流程電泳遷移率變動測定電泳遷移率變動測定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或稱凝膠遷移變動實驗或稱凝膠遷移變動實驗(

20、gel shift assay)最初用于研究最初用于研究DNA結合蛋白與相應結合蛋白與相應DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經成為轉錄因子研究的經典方法。目前這一技已經成為轉錄因子研究的經典方法。目前這一技術也被用于研究術也被用于研究RNA結合蛋白和特定結合蛋白和特定RNA序列間序列間的相互作用。的相互作用。二、二、DNA-蛋白質相互作用分子分析技術蛋白質相互作用分子分析技術（一）電泳遷移率變動測定（一）電泳遷移率變動測定放放射射自自顯顯影影未結合探針未結合探針結合有蛋白的探針結合有蛋白的探針標記探針標記探針1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋

21、白提取物1X10X10X未標記探針未標記探針10Xn凝膠遷移實驗結果示意圖凝膠遷移實驗結果示意圖染色質免疫沉淀技術染色質免疫沉淀技術(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是目前可是目前可以研究體內以研究體內DNA與蛋白質相互作用的與蛋白質相互作用的主要方法。主要方法。（二）染色質免疫沉淀法（二）染色質免疫沉淀法n染色質免疫沉淀實驗流程及結果示意圖染色質免疫沉淀實驗流程及結果示意圖二、二、RNA-蛋白質相互作用分子分析技術蛋白質相互作用分子分析技術RNARNA結合蛋白免疫沉淀（結合蛋白免疫沉淀（RNA RNA Binding Protein Immu

22、noprecipitationBinding Protein Immunoprecipitation，RIPRIP），是研究細胞內），是研究細胞內RNARNA與蛋白結合與蛋白結合情況的技術。情況的技術。應用范圍：應用范圍：研究蛋白與研究蛋白與DNADNA動態作用動態作用研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達之間的關系研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達之間的關系研究蛋白與研究蛋白與RNARNA的相互作用的相互作用激光共聚集顯微鏡應用技激光共聚集顯微鏡應用技術術Laser Scanning Confocal Microscopy(LSCM)激光經放大、激光經放大、分光后由物鏡分光后由物鏡聚焦于焦平面聚

23、焦于焦平面上，同時，焦上，同時，焦平面上被激光平面上被激光掃描的點掃描的點F F所發所發出的一定波長出的一定波長的熒光通過檢的熒光通過檢測針孔光欄達測針孔光欄達到檢測器，并到檢測器，并成像于顯示器成像于顯示器上，得到相應上，得到相應的熒光圖象。的熒光圖象。n激光共聚焦顯微鏡工作原理示意圖激光共聚焦顯微鏡工作原理示意圖n人眼及各類顯微鏡分辯率人眼及各類顯微鏡分辯率 人眼分辯率人眼分辯率 光學顯微鏡分辯率光學顯微鏡分辯率 共焦顯微鏡分辯率共焦顯微鏡分辯率 電子顯微鏡分辯率電子顯微鏡分辯率 激光共聚焦顯微鏡有四個熒光通道，一個透射激光共聚焦顯微鏡有四個熒光通道，一個透射光通道光通道n激光共聚焦顯微鏡

24、的應用激光共聚焦顯微鏡的應用 定位、定量定位、定量 三維重組三維重組 動態測量動態測量 活細胞或組織內游離活細胞或組織內游離Ca2+分布和濃度的變化分布和濃度的變化 測量測量(Mg2+、Zn+、Na+、K+)自由基的檢測自由基的檢測 藥物進入細胞的動態過程、定位分布及定量藥物進入細胞的動態過程、定位分布及定量 蛋白質的轉位蛋白質的轉位 活細胞內活細胞內H+濃度（濃度（pH值）的測量值）的測量 線粒體膜電位的測量線粒體膜電位的測量 熒光漂白恢復（熒光漂白恢復（FRAP）的測量）的測量 籠鎖解籠鎖的測量籠鎖解籠鎖的測量 熒光能量共振轉移（熒光能量共振轉移（FRET）的測量）的測量 其他應用其他應用