Survivin基因siRNA對胃癌細胞生長的抑制作用.doc

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1、Survivin基因siRNA對胃癌細胞生長的抑制作用2007年l2月第22卷第l2期ChinJGenSurg.December2Oo7.v01.22.No.12Survivin基因siRNA對胃癌細胞生長的抑制作用賈紹昌蘇長青張衛兵王躍華俞永忠【摘要】目的構建攜帶沉寂Survivin基因的特異性siRNA的表達質粒,鑒定其在胃癌細胞內對Survivin基因表達的沉寂以及對腫瘤細胞生長的抑制.方法合成Survivin基因特異性siRNA,插入到表達載體pAdGFP中構建成pAdGFPsiRNA.培養人胃癌細胞SGC-7901,轉染pAdGFPsiRNA,研究該載體在人胃癌細胞內對Survivi

2、n基因表達的抑制作用以及對腫瘤細胞生長的抑制作用.結果轉染pAdGFPsiRNA后,胃癌細胞SGC-7901的生長受到明顯抑制,抑制率為68.2%.免疫組化檢查顯示,特異siRNA顯著降低了癌細胞Survivin基因的表達.結論siRNA技術能夠沉寂Survivin基因的表達,抑制癌細胞的生長,改善治療效果.【關鍵詞】胃腫瘤;基因;遺傳載體;轉染EffectsofsurvivingenesiRNAonthegrowthofgtHccancercelllineJIAShaochang.SUChangqing,zG耽bing,WANGYuehurt,YUYongzhong.Departmentof

3、SurgicalOncology,Nang81HoitaloftheChinesePeoplesLiberationArmy,Nang210002,ChinaCorrespondingauthor:SUChangqing,Email:ChangqingEHBH.cn【Abstract】ObjectiveToconstructanexpressionplasmidcarryingthespecificsiRNAofsurvivingene.andtoevaluateitssilencingeffectontheexpressionofsurvivingeBeanditsinhibitioneff

4、ectonthegrowthofgastriccancercells.MethodsThespecificsiRNAofsurvivingeneWasdesignedandsynthesized.andanexpressionplasmidpAdGFPsiRNAWasconstructed.GastriccancercelllineSGC-7901WasculturedandtransferredwithpAdGFPsiRNA,thenthesilencingofsurvivingeneexpressionandthegrowthinhibitionofcancercellmediatedby

5、pAdGFPsiRNAwereidentified.ResultsThegrowthofgastriccancercellsWasinhibitedaftertmnsrringthepAdGFPsiRNA.withtheinhibitionrateof68.2%comparedtothecontrolgroup.ImmunohistochemistryshowedthatthespecificsiRNAmarkedlysilencedtheexpressionofsurvivingeneincancercells.ConclusionsTheoverexpressionofsurvivinge

6、neingastriccancercellsresultsinthehighproliferationandtheresistancetothechemoandradiotherapyofthecancercells.ThespecificsiRNAcanmarkedlysilencetheexpressionofsurvivingeneandinhibitthegrowthofcancercells.【Keywords】Stomachneoplasms;Genes;Geneticvectors;TransfectionSurvivin基因是一種癌基因,參與細胞凋亡的抑制作用.國內外研究發現,

7、Survivin在多種人體惡性腫瘤組織中高表達,能夠促進細胞的增殖,并直接導致腫瘤細胞對常規放,化療的抗性-引.因此,Survivin已成為有希望的腫瘤治療的選擇性靶點,抑制腫瘤細胞的Survivin表達就可以促進腫瘤細胞凋亡,從而起到治療腫瘤的作用J.已有實驗證實,抑制Survivin基因表達可以誘導多種腫瘤細胞發生凋亡,并且在實驗動物體內抑制腫瘤生長引,但有基金項目:國家自然科學基金資助項目(30572149)作者單位:210002南京,解放軍第八一醫院腫瘤外科(賈紹昌,張衛兵.王躍華,俞永忠);第二軍醫大學東方肝膽外科醫院(蘇長青)通信作者:蘇長青,Email:ChangqingEHBH

8、.cn?925?.論著關胃癌Survivin基因的表達與干擾的報道極少.本研究采用表達質粒載體介導的RNA干擾技術,沉寂胃癌細胞Survivin基因的表達,研究Survivin基因靶向抑制與腫瘤細胞生長之間的關系.材料與方法一,細胞培養人胃癌細胞株SGC-7901由中科院上海細胞研究所提供,在含10%胎牛血清的DMEM培養液,37oC,5%CO,孵箱中培養.二,Survivin基因siRNA合成根據Survivin基因序列設計相應的siRNA,目標基因序列位于全長Survivin編碼序列的第387405bp.合成的編碼siRNA的DNA結構克隆人?926?志2007年l2月第22卷第l2期Ch

9、inJGenSurg.December2007.Vo1.22.No.12T載體,并經過測序確認.同時設計陰性對照序列,以同樣的DNA結構克隆入T載體.三,表達載體的構建將克隆的T載體采用XhoI+Bg酶切(日本Takara公司),回收目的基因片段,插入到表達質粒pAdGFP中,經酶切鑒定正確后,命名為pAdGFPsiRNA和pAdEGFPsiRNA(一).四,細胞學實驗人胃癌細胞株SGC-7901,110細胞數鋪96孔板2塊,培養24h.參考LipoFactamine2000轉染試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書,轉染質粒pAdGFP-siRNA或pAdGFPsiRNA(一),轉染質

10、粒量為10ng10g,共7個梯度.對應于每個梯度值設8個復孔.繼續培養48h后,將其中一塊板棄去培養液,加入0.1moL/LPBS溶液100l/:fL充分洗滌.采用免疫組化SP法定位腫瘤細胞中Survivin的表達.鼠抗人Survivin單克隆抗體和sP試劑盒購自福州邁新生物技術公司.在5個高倍視野下計數每個培養孔內陽性細胞的比例.另一塊板培養7d后棄去培養液,加入0.1moL/LPBS溶液100l/孔,再加M1Tr標記試劑10I/孔至終濃度0.5mg/ml,置孵箱內4h.加稀釋液100l/孔,置孵箱內過夜.用酶標儀測定570nm波長光吸收值,校正波長為655nm.繪制細胞存活曲線.五,統計學

11、處理兩兩數據之間比較采用配對資料t檢驗,多組之間比較用ANOVA單因素方差分析進行.結果一,Survivin基因siRNA表達載體的鑒定設計并合成Survivin基因siRNA序列,構建其表達載體質粒.經酶切鑒定正確,命名為pAdGFP-siRNA(圖1).二,Survivin基因siRNA對基因表達的抑制作用在轉染pAdGFP.siRNA后48h,熒光顯微鏡下觀察人胃癌細胞株SGC-7901細胞的綠色熒光蛋白表達,保證病毒對細胞的感染效率.收集細胞,用免疫組化方法檢測腫瘤細胞Survivin的表達.結果發現,隨著pAdGFP.siRNA轉染量的增加,細胞Survivin的表達逐漸下降,在50

12、0ng質粒轉染10細胞數時,對Survivin表達的抑制接近高峰值,Survivin表達陽性率降低至29.3%4.6%(圖2A).而同時進行的pAdGFPsiRNA(一)和不加質粒的陰性對照,Survivin表達陽性率基本保持在80.3%8.9%和81.1%10.8%,與pAdGFPsiRNA轉染組比較差異有統計學意義(P<0.01).bpM21226一148-.,426835302027l9O41584137594782】564M:LambdaDNA/EcoRl+HindIHMarker;S:pAdGFP-siRNA/Xhol+EcoRl1481+7231bp圖1表達Survivin基

13、因siRNA的表達載體的酶切鑒定三,細胞存活的實驗人胃癌細胞株SGC-7901在轉染pAdGFPsiRNA后,采用M1Tr技術檢測細胞存活曲線.結果發現,隨著pAdGFPsiRNA轉染量的增加,癌細胞的存活率逐漸下降.在1g質粒轉染量的時候,細胞的存活率已經下降到50%以下(圖2B).而同時進行的pAdGFP-siRNA(一)和不加質粒的陰性對照,細胞的存活率持續在80%以上,與pAdGFP-siRNA+pAdEGFPsiRNA12O1oo8O60旺4O墓目2O14012O一1008060萋;4o2OO10501005001000500010000質粒轉染量(ng)-pAdEGFPsiRNA1

14、0501005001000500010000質粒轉染量(ng1圖2pAdGFP-siRNA沉寂Survivin表達(2A)以及抑制胃癌細胞生長的作用(2B)主堡萱通抖盍Qo7生鲞第l2期ChinJGenSurg,December2007.Vo1.22,No.12轉染組比較差異有統計學意義(P<0.01).討論凋亡抑制基因Survivin編碼一個由142個氨基酸組成的蛋白因子,該蛋白因子通過與Caspase-9結合間接促進凋亡抑制蛋白因子IAPs的抗凋亡作用.Survivin基因具有腫瘤特異性,只表達于腫瘤和胚胎組織,在各種人體腫瘤組織中呈高表達狀態,且與腫瘤細胞的分化增殖及浸潤轉移密切相

15、關.其過度表達的蛋白因子不但具有促進腫瘤細胞增殖,抑制腫瘤細胞凋亡的作用,而且能夠降低腫瘤細胞對放療和化療的敏感性.而在分化成熟的正常組織中Survivin不表達或極少表達.一些臨床研究已經證實了Survivin基因表達的高低影響化療敏感性.因此,Survivin被認為是腫瘤治療的理想靶點之一.已有研究證實,Survivin反義cDNA轉染HeLa細胞可降低細胞Survivin的表達水平,同時可誘導Hela細胞的凋亡,抑制其增殖.Survivin突變序列轉染Hela細胞后同樣能夠逆轉Hela細胞的惡性程度,促進Hela細胞的凋亡.應用RNA干擾(RNAinterference,RNAi)抑制S

16、urvivin目的基因的表達進行腫瘤的治療研究也取得了一些進展.本研究構建了能夠表達Survivin基因特異性siRNA的質粒載體,轉染腫瘤細胞后,發揮封閉Survivin基因表達的作用.Survivin特異性siRNA技術在細胞學實驗中取得了良好的抗腫瘤效應,能夠明顯抑制腫瘤細胞的生長.因此,針對Survivin為靶點的腫瘤基因治療方法具有很好的應用前景.將表達Survivin特異性siRNA的質粒載體用于胃癌的體外殺傷實驗,發現Survivin特異性siRNA能夠很好地沉寂Survivin基因的表達,抑制腫瘤的生長.這種抑制腫瘤細胞生長的作用可能與抑制Survivin表達引起癌細胞凋亡或周

17、期阻滯有關.由此證實,針對Survivin的基因治療具有良好的靶向性,特異性及安全性,既可以克服反義核苷酸治療的不足,又可以聯合應用放療和化療,與其他促凋亡治療方法相結合將能最大限度地發揮抗腫瘤效應.參考文獻1YamashitaS,MasudaY,KurizakiT,eta1.Survivinexpressionpredictsearlyrecurrenceinearlystagebreastcancer.AnticancerRes,2007,27:2803-2808.2JohnsonME,HowehEW.Survivin:abifunctionalinhibitorofapoptosispr

18、otein.VetPathol,2004,41:599607.3ShiM,GuoXT,ShuMG,eta1.Enhancingtumorradiosensitivitybyintracellulardeliveryofsurvivinantagonists.MedHypotheses,2007,68:10561058.4KimaH,IidaM,YaguchiY,eta1.Enhancementofcisplatinsensitivityinsquamouscellcarcinomaoftheheadandnecktransfectedwithasurvivinantisensegene.Arc

19、hOtolaryngolHeadNeckSurg,200I6,132:68285.5SunY,LinR,DaiJ,eta1.Suppressionoftumorgrowthusingantisenseoligonucleotideagainstsurvivininanorthotopictransplantmodelofhumanhepatocellularcarcinomainnudemice,Oligonucleotides,20o6,l6:36574.6LippeflBM,KnauerSK,FetzV,eta1.Dynamicsurvivininheadandneckcancer:mol

20、ecularmechanismandtherapeuticpotentia1.IntJCancer,2007,121:11691174.7BeardsmoreDM,VerbekeCS,DaviesCL,eta1.Apoptoticandproliferativeindexesinesophagealcancer:predictorsofresponsetoneoadjuvanttherapy.JGastrointestSurg,2003,7:7786.8FerrarioA,RuckerN,WongS,eta1.Survivin,amemberoftheinhibitorofapoptosisf

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22、humancoloncancer.EurJCancer,2002,38:2316-2324.1O朱紅霞,周翠琦,張果,等.突變型Survivin逆轉Hela細胞惡性表型的研究.癌癥,2003,22:467470.11PaduanoF,VillaR,PennatiM,eta1.SilencingofsurvivingenebysmallinterferingRNAsproducessupra?additivegrowthsuppressionincombinationwith17?-allylamino?-17?-demethoxygeldanamycininhumanprostatecancercells.MolCancerTher.200I6,5:179186.(收稿日期:20070419)(本文編輯:王黛)