蛋白質的測定1

《蛋白質的測定1》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《蛋白質的測定1（54頁珍藏版）》請在裝配圖網上搜索。

1、蛋白質的測定最新第六章 蛋白質和氨基酸的測定蛋白質的測定最新第一節第一節 概述概述1.蛋白質概況 蛋白質是含氮的有機化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五種元素組成。某些蛋白質中還含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。蛋白質是生命的物質基礎，人體11%-13%總熱量來自蛋白質。無論動物、植物都含有蛋白質，只是含量及類型不同。蛋白質是食品的最重要質量指標，其含量與分解產物直接影響食品的色、香、味及其營養。蛋白質的測定最新 一般說來，動物性食品的蛋白質含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白質含量為 20.0%左右，豬肉 9.5%，兔肉 21%，雞肉 20%，牛乳 3.5%，帶魚 18.0%，大豆

2、 40%，面粉 9.9%，菠菜 2.4%，黃瓜 1.0%，蘋果 1.4%測定食品中的蛋白質的含量，對于評價食品的營養價值，合理開發利用食品資源、提高產品質量、優化食品配方、指導經濟核算及生產過程控制均具有極其重要的意義。蛋白質的測定最新 一類是利用蛋白質的共性即含氮量、肽鍵和折射率等測定蛋白質含量；凱氏定氮法、雙縮脲反應、福林-酚試劑法、染料結合反應。一類是利用蛋白質中的特定氨基酸殘基、酸性和堿性基因以及芳香基團等測定蛋白質含量。紫外測定、酸堿滴定法。蛋白質的測定方法分兩大類蛋白質的測定最新第二節 蛋白質的定量測定一、凱氏定氮法由由Kieldhl于于1833年提出，現發展為常量、微量、年提出，

3、現發展為常量、微量、自動定氮儀法，半微量法及改良凱氏法。用凱氏定自動定氮儀法，半微量法及改良凱氏法。用凱氏定氮法測定總氮量，然后乘一個蛋白質換算系數。氮法測定總氮量，然后乘一個蛋白質換算系數。16%N=N6.25=蛋白質含量蛋白質含量乳制品K=6.38（N=15.7%）小麥粉K=5.79（N=17.6%）動物膠K=5.6（N=18.0%）冰蛋K=6.7（N=14.8%）大豆制品K=6.0（N=16.7%）蛋白質的測定最新v在食品和生物材料中常包括蛋白質，可能還包括有非蛋白質含氮的化合物，如核酸、含氮碳水化合物、生物堿等；含氮類脂、卟啉和含氮的色素，所以只能稱為粗蛋白的含量。國際標準ISO 18

4、711975農產食品凱氏法測定氮含量的一般性說明v含非蛋白質氮多的食品要單獨測 GB/T 21704-2008乳與乳制品中非蛋白氮含量的測定蛋白質的測定最新1、原理整個過程分三步：消化,蒸餾和吸收,滴定 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。用H3BO3吸收后,再以標準HCl溶液滴定。根據標準酸消耗量可以計算出蛋白質的含量。蛋白質的測定最新（1）消化總反應式2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4 (NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用濃硫酸（一定要用濃硫

5、酸（98%）原理蛋白質的測定最新加硫酸鉀 作為增溫劑，提高溶液沸點，Gunning將消化方法改進，在消化時加入K2SO4使沸點上升，這樣加快分解速度，溫度由原來硫酸沸點的330上升到400，提高了67，所以速度也就加快了。隨著消化反應過程，水份逸出，硫酸鉀濃度增大，使沸點增加。加速了有機的分解。也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提高沸點，但效果不如硫酸鉀。蛋白質的測定最新 v但是硫酸鉀濃度不可以太高，否則溫度太高，生成的硫酸氫銨會分解放出氨，造成氨的損失。K2SO4和H2SO4的添加比例是：1g樣品中 K2SO4:H2SO4=7g:12mL蛋白質的測定最新 加硫酸銅 作為催化劑，還可以做蒸餾時堿性指示劑

6、。CuSO4 Cu2SO4+SO2+O2C+CuSO4 Cu2SO4+SO2+CO2H2SO4+Cu2SO4 CuSO4+SO2+2H2O氧化汞、汞（均有毒，價格貴）、硒粉、二氧化鈦。加氧化劑 如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機物氧化速度。受熱蛋白質的測定最新消化裝置蛋白質的測定最新（2）蒸餾 消化液+40%氫氧化鈉加熱蒸餾，放出氨氣。(NH4)2SO4+NaOHNH3+Na2SO4+H2O原理蛋白質的測定最新（3）吸收與滴定用2%硼酸吸收，用鹽酸標準溶液滴定.2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O2NH4Cl+4H3BO4指示劑用混合指示劑（甲

7、基紅溴甲基酚綠混合指示劑）指示劑 紅色 綠色 紅色 （酸）（堿）（酸）甲基紅溴甲基酚綠混合指示劑：變色點pH 5.1酒紅色綠色吸收吸收滴定滴定原理蛋白質的測定最新2 實驗步驟（1）樣品消化 稱取適量樣品0.12g（固體），移入干燥的消化管中，加入0.2g硫酸銅，3g硫酸鉀及20mL硫酸，輕輕搖勻后進行消化。先小火消化，待消化液呈藍綠色澄清透明后，再繼續大火加熱0.5h，至溶液呈透明淡黃綠色為止。?；鹄鋮s后，將消化液用水定容至100 mL?？瞻讓φ眨喝∨c處理樣品相同量的硫酸銅，硫酸鉀，硫酸按同一方法作試劑空白試驗。蛋白質的測定最新（2）堿化蒸餾向接收瓶內加入10mL2%硼酸及2滴混合指示劑并使冷

8、凝管下端插入液面下。吸取10.0mL樣品消化稀釋液注入凱氏定氮儀的反應室中，用10mL蒸餾水沖洗進樣入口，再加10mL50%氫氧化鈉溶液，通入蒸汽開始蒸餾，并通過冷凝管而進入接收瓶內，以第一滴餾液滴下開始計時，蒸餾5min，取下接收瓶。停止蒸餾。蛋白質的測定最新（3）滴定用微量酸式滴定管，以0.05mol/L鹽酸標準溶液進行滴定，溶液由藍綠色變為灰紅色為終點。（4）空白試驗同時取10.0mL空白消化稀釋液同上操作。實驗步驟蛋白質的測定最新（5）計算總氮量%=N(V2-V1)0.014/W 1000.014-氮的毫克當量數蛋白質%=總氮%KK-換稱等數：換稱等數：乳制品K=6.38（N=15.7

9、%）小麥粉K=5.79（N=17.6%）動物膠K=5.6（N=18.0%）冰蛋K=6.7（N=14.8%）大豆制品K=6.0（16.7%）K=6.25（N=16%）實驗步驟蛋白質的測定最新(1)所用試劑溶液應用無氨蒸餾水配制。(2)消化時不要用強火，應保持和緩沸騰，勿使炭化物質上升到消化管上部。待消化液均勻沸騰后，再加大火力。(3)消化時應注意不時轉動凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下，并促進其消化完全。3 注意事項蛋白質的測定最新(4)如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失。而硫酸不與氨作用，因此當硫酸過多被底物消耗掉或樣品中脂肪含量過高時，要添加硫酸量。(5)樣品中若含脂

10、肪較多時，消化過程中易產生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時應用小火加熱，并時時搖動；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時注意控制熱源強度。注意事項蛋白質的測定最新(6)般消化至呈透明后，繼續消化30min即可，但對于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時，需適當延長消化時間。有機物如分解完全，消化液呈藍色或淺綠色，但含鐵量多時，呈較深綠色。注意事項蛋白質的測定最新北京福德泰和科技有限公司北京福德泰和科技有限公司產品名稱：產品名稱：凱氏定氮儀凱氏定氮儀 蛋白質的測定最新二、雙縮脲法傳統的凱氏定氮法應用范圍廣，靈敏度高、準確，不要大儀器，

11、但費時間，有環境污染。新開發的：雙縮脲法、紫外分光光度法、染料結合法、水楊酸比色法蛋白質的測定最新脲（尿素）NH2CONH2 加熱至150160時，兩分子縮和成雙縮脲。雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡和物，這種反應叫雙縮脲反應（縮二脲反應）。NH2CONHCONH2 +NH3NH2CONH2+NH2CONH21 原理蛋白質的測定最新蛋白質分子中含有肽鍵 CONH 與雙縮脲結構相似。堿性條件下，蛋白質與銅作用生成蛋白質-銅絡合物，溶液紫紅色的深淺與蛋白質含量在一定范圍內符合朗伯一比爾定律，而與蛋白質的氨基酸組成及分子量無關?？捎梅止夤舛扔媮頊y其吸光度，確定含量。（560nm）蛋白質的測定最新

12、堿性酒石酸鈉：10mL KOH(10mol/L)溶液和20mL 酒石酸鉀鈉(25%)加到930mL水中，激烈攪拌，同時加入4%CuSO4液40mL。2 試劑蛋白質的測定最新v（1）標準曲線繪制 取蛋白質液0.0 2.0 4.0 8.0 10.0mL于10mL容量瓶分別加水定容10mL 加50mL堿性酒石酸鉀鈉吸混合液15mL離心到完全透明取上清液5mL于10mL容量瓶加水定容 560nm處測定吸光度以吸光值和蛋白質含量繪制標準曲線（2）樣品測定：準確稱樣0.5g于10mL離心管加50mL堿性酒石酸鉀鈉同上，560nm處測定吸光度，從標準曲線上查出蛋白質含量。3 試驗方法蛋白質的測定最新v雙縮脲

13、法對白、紅蛋白產生的顏色反應相近，不受溫度影響?？煽焖贉y定蛋白質含量，但靈敏度低，測定范圍為120mg蛋白質，適用于精度要求不高的蛋白質含量測定，常用于谷物蛋白質含量測定。v三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等對本反應有干擾。方法特點及應用范圍蛋白質的測定最新三、Folin-酚法測定蛋白質含量 1.原理：Folin-酚試劑法包括兩步反應：v第一步是在堿性條件下，蛋白質與銅作用生成蛋白質-銅絡合物；v第二步是此絡合物將磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin-酚試劑)還原，產生深藍色(磷鉬藍和磷鎢藍混合物)，顏色深淺與蛋白質含量成正比。因為Folin-酚試劑在堿性溶液中極不穩定，易被酚類化合物氨基酸（

14、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸）還原為藍色化合物（鉬蘭和鎢蘭混合物）,在750nm有最大吸收。蛋白質的測定最新實驗的優點：vFolin-酚法廣泛應用于水溶性蛋白質含量的測定。vFolin-酚法的靈敏度比雙縮脲法高100倍，肽鍵顯色效果增強，減少了因蛋白質種類引起的偏差。該法由于兩步呈色反應可以疊加，其靈敏度特別高，所以適于20250ug微量蛋白質的測定，可檢測的最低蛋白質量達5 ug。蛋白質的測定最新2.試劑Folin-酚試劑 試劑甲：（A）稱取10g Na2CO3，2g NaOH和0.25g酒石酸鉀鈉，溶解后用蒸餾水定容至500mL。（B）稱取0.5g CuSO45H2O，溶解后用蒸餾水定容至10

15、0mL。每次使用前將（A）液50份與（B）液1份，即為試劑甲。蛋白質的測定最新試劑乙：在1.5L容積的磨口回流器中加入100g鎢酸鈉和700mL蒸餾水，25g鉬酸鈉，再加50mL 85 磷酸和100mL濃鹽酸充分混勻，接上回流冷凝管，以小火回流10h?；亓鹘Y束后，加入150g硫酸鋰和50mL蒸餾水及數滴液體溴，開口繼續沸騰15min，驅除過量的溴，冷卻后溶液呈黃色。然后稀釋至1L，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。蛋白質的測定最新3.試驗方法(1)標準曲線的制作配制標準牛血清白蛋白溶液：250g/mL的牛血清白蛋白溶液，取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,加水定容至1.0mL,配

16、成一系列不同濃度的牛血清白蛋白溶液。然后各加Folin-酚試劑甲5mL，混合后在室溫下放置10min，再各加0.5 mLFolin-酚試劑乙，立即混合均勻，靜止30min后。以不含蛋白質的1號試管為對照，用分光光度計于750nm波長下測定各試管中溶液的光密度并記錄結果。以牛血清白蛋白含量（g）為橫坐標，以光密度為縱坐標繪制標準曲線。蛋白質的測定最新(2)樣品的提取及測定準確稱取樣品1g，放入研缽中，加蒸餾水2mL，研磨勻漿。將勻漿轉入離心管，并用 6mL蒸餾水分次將研缽中的殘渣洗入離心管.離心4 000r/min、20min。將上清液轉入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度，作為待測液備用。(

17、3)取普通試管2支，各加入待測溶液1mL，分別加入試劑甲5mL，混勻后放置10min，再各加試劑乙0.5mL，迅速混勻，室溫放置30min，于750nm波長下測定光密度，并記錄結果。蛋白質的測定最新計算 v從標準曲線中查出相對應的蛋白質含量X（g），再計算樣品中蛋白質的百分含量。蛋白質含量（）=X（g）稀釋倍數(樣品重106)蛋白質的測定最新試驗注意事項（1）Folin乙試劑僅在酸性pH條件下穩定，但此實驗的反應只是在pH10的情況下發生，所以當加試劑乙時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前即能發生還原反應，否則會使顯色程度減弱。（2）Folin試劑顯色反應由酪氨酸、色氨酸和半胱

18、氨酸引起，不同蛋白質含量不同而使顯色強度稍有不同。本法也可用于游離酪氨酸和色氨酸含量測定。蛋白質的測定最新3）酚類和檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油、還原劑(二硫代蘇糖醇、巰基乙醇）EDTA和脲素均會干擾反應。但質量分數或體積分數在5時，尿素、硫酸鈉、硝酸鈉、三氯乙酸、乙醇、乙醚和丙酮對顯色無影響，高濃度時必須作校正曲線。蛋白質的測定最新四紫外吸收法 1.1.原理：構成蛋白質的20種氨基酸在可見光區都沒有光吸收，但在遠紫外區(220nm)均有光吸收。在近紫外區(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力，最大吸收峰在280nm波長處。在此波長范圍內，在蛋白

19、質濃度38mg/mL OD280nm光密度與其濃度呈正比關系，可作定量測定。蛋白質的測定最新應用：紫外吸收法測蛋白質含量迅速、簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此，已在蛋白質和酶的生化制備中廣泛采用，尤其在柱層析分離純化中，常用280nm進行紫外檢測，來判斷蛋白質吸附或洗脫情況。蛋白質的測定最新2.試劑v（1）標準牛血清蛋白溶液：準確稱取經凱氏定氮法校正的結晶牛血清蛋白，配制成濃度為1mg/mL的溶液。v（2）待測蛋白質溶液：濃度為1mg/mL左右的溶液。蛋白質的測定最新3.實驗方法v(1)標準曲線制作 選一種與待測樣本蛋白質氨基酸組成相近似的蛋白質純品，分別向每支試管內加入0,0.5

20、,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0mL溶液，加蒸餾水定容到5.0mL,混勻。以光程為1cm的石英比色杯，在280nm波長處測定各管溶液的光密度值OD280nm。以蛋白質濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪出標準曲線。蛋白質的測定最新v(2)樣品測定取待測蛋白質溶液1mL，加入蒸餾水定容至5mL，混勻，按上述方法測定280nm的光密度，并從標準工作曲線上查出待測蛋白質溶液的濃度。蛋白質的測定最新v1、對于測定那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質，有一定的誤差。故該法適于測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。v2、溫度對蛋白質水解有影響，操作溫度應控制在2030。4.實驗注意

21、蛋白質的測定最新(3)實驗中不飽和醛、酮、嘌呤、嘧啶和核苷酸都有紫外吸收，所以使結果偏高。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶堿)的影響更為嚴重。然而核酸的最大吸收峰是在260nm。因此溶液中同時存在核酸時，必須同時測定OD260nm與OD280nm，然后根據兩種波長的吸收度的比值，通過經驗公式校正，以消除核酸的影響而推算出蛋白質的真實含量。通常純蛋白質的OD280nm/OD260nm 約為1.8，而純核酸的比值約為0.5。蛋白質的測定最新利用經驗公式直接計算樣本蛋白質含量a、OD280OD2601.5時，用Lowry-Kalokar公式：樣本蛋白質含量(mg/mL)1.45 OD280一0.74 OD2

22、60b.根據OD280nm/OD260nm,從校正因子表查出校正因子“F”值，同時可查出該樣品內混雜的核酸的百分含量，將F值代入下述公式，即可計算出該溶液的蛋白質濃度。蛋白質濃度（mg/mL）=FOD280nm蛋白質的測定最新紫外吸收法測定蛋白質含量的校正因子OD280nm/OD260nm校正因子校正因子核酸核酸%OD280nm/OD260nm校正因子校正因子核酸核酸%1.751.1160.000.8460.6565.501.631.0810.250.8220.6326.001.521.0540.500.8040.6076.501.401.0230.750.7840.5857.001.360.

23、9941.000.7670.5657.51.300.9701.250.7530.5458.001.250.9441.500.7300.5089.001.160.8992.000.7050.47810.001.090.8522.500.6710.42212.001.030.8143.000.6440.37714.000.9790.7763.500.6150.32217.000.9390.7434.000.5950.27820.000.8740.6825.00 蛋白質的測定最新四.考馬斯亮藍G-250法1.原理 考馬斯亮藍G-250（Coomassie brilliant blue G-250）測

24、定蛋白質含量屬于染料結合法的一種?？捡R斯亮藍G-250在游離狀態下呈紅色，最大吸光吸收在488 nm；當它與蛋白質結合后變為青色，蛋白質-色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速；其結合物在室溫下1h內保持穩定。595nm光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用于蛋白質的定量測定。蛋白質的測定最新特點：v該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡單，操作簡便快捷.v考馬斯亮藍G-250法是目前靈敏度最高的蛋白質測定方法，最低蛋白質檢測量可達1ug，比Folin一酚法約高4倍。測定蛋白質濃度范圍為01000g/m

25、L，是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。蛋白質的測定最新2.實驗試劑v蛋白試劑考馬斯亮藍G-250的配制：稱取100mg考馬斯亮藍G-250，溶于50mL 90乙醇中，加入85（W/V）的磷酸100mL，最后用蒸餾水定容到1L。此溶液在常溫下可放置一個月。蛋白質的測定最新3.試驗方法(1)標準曲線制作v0100g/mL標準曲線的制作：取6支10mL干凈的具塞試管，取0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.10mL,用蒸餾水定容至1.0mL.加考馬斯亮藍G-250試劑5mL,蓋塞后，將各試管中溶液縱向倒轉混合.v比色：放置2min后,用1cm光經的比色杯在595nm波長下比色，記錄各管測

26、定的光密度OD595nm，并做標準曲線.蛋白質的測定最新標準曲線制作管 號1234561 000gmL標準蛋白液（mL）00.020.040.060.080.10蒸餾水（mL）1.000.980.960.940.920.90考馬斯亮藍G-250試劑（mL）555555蛋白質含量（g）020406080100OD595nm 蛋白質的測定最新待測液蛋白質濃度測定管 號1314蛋白質待測樣品提取液（mL）0.10.1蒸餾水（mL）0.90.9考馬斯亮藍G-250試劑（mL）5 5 OD595nm蛋白質含量（g）(2)樣品蛋白質的測定蛋白質的測定最新4.實驗注意1、該方法干擾物質少，如糖、緩沖液、還原劑和絡合劑等均不影響顯色。仍有強堿性緩沖液、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)、去污劑等干擾該反應?？捡R斯亮藍G-250與蛋白質的反應物易附著在比色杯內壁上。2、蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合的反應十分迅速，在2min左右反應達到平衡；其結合物在室溫下1h內保持穩定。因此測定時，不可放置太長時間，否則將使測定結果偏低。3、該法主要問題是線性關系較差，在蛋白質含量很高時線性偏低。H濃度是影響線性關系的主要因素。蛋白質的測定最新4、不同來源蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合狀況有一定差異。