負染技術、掃描電鏡樣品制備技術

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1、負染技術負染技術 陰性反差染色，染色劑不被樣品吸收而是沉淀陰性反差染色，染色劑不被樣品吸收而是沉淀到樣品四周。用于細菌、病毒、噬菌體、亞細胞到樣品四周。用于細菌、病毒、噬菌體、亞細胞成份的檢測。成份的檢測。（一）染色液的特點（一）染色液的特點 1.1.不和樣品發生反應不和樣品發生反應 3.3.可提供足夠高的反差可提供足夠高的反差 （二）操作方法操作方法 待檢生物組織懸液滴于載網，靜置待檢生物組織懸液滴于載網，靜置5-10 min5-10 min 用濾紙吸去載網邊緣多余液體用濾紙吸去載網邊緣多余液體 載網未完全干載網未完全干 滴染色液，染色滴染色液，染色3-5min3-5min 用濾紙吸去載網邊

2、緣多余液體，自然干燥，鏡檢用濾紙吸去載網邊緣多余液體，自然干燥，鏡檢 (三三)影響因素影響因素 1.1.被檢樣品純度和濃度被檢樣品純度和濃度 2.2.染色液染色液pH 3.pH 3.操作技巧操作技巧 掃描電鏡生物樣品制備技術掃描電鏡生物樣品制備技術 含水量少的組織含水量少的組織(骨骼、牙齒、毛發等骨骼、牙齒、毛發等)預處理、導電預處理、導電 含水量多的組織含水量多的組織(大多數組織大多數組織)預處理、預處理、干燥、干燥、導電導電一一 樣品預處理樣品預處理(一一)常規樣品常規樣品 5 58 mm8 mm，保護觀察面保護觀察面 漂洗、沖洗、擦洗，快！漂洗、沖洗、擦洗，快！3.3.固定、脫水固定、脫

3、水 同超薄切片同超薄切片 (二二)游離細胞游離細胞 收集所需細胞收集所需細胞 適量適量0.1%0.1%多聚賴氨酸多聚賴氨酸 PBSPBS洗滌，洗滌，1000rpm 5min,1000rpm 5min,棄上清棄上清 4 46 mm6 mm玻片玻片,室溫室溫5-10min5-10min 滴入滴入2-4ml 0.5%2-4ml 0.5%戊二醛，戊二醛，4 4o oC 0.5h C 0.5h 吸去多余液體吸去多余液體,成膜成膜 PBSPBS洗滌，洗滌，1000 rpm 5min,1000 rpm 5min,棄上清，制成懸液棄上清，制成懸液 細胞懸液滴于玻片，細胞懸液滴于玻片，5-30min5-30mi

4、n濾紙吸去多余液體濾紙吸去多余液體 1%1%戊二醛，戊二醛，4 4o oC 1hC 1h PBS PBS漂洗，漂洗，1%OsO1%OsO4 4，4 4o oC 1hC 1h，梯度酒精脫水，梯度酒精脫水膜未干膜未干（三）欲看剖面的結構三）欲看剖面的結構實質性臟器的斷面或細胞內部實質性臟器的斷面或細胞內部 用用“割斷法割斷法”暴露觀察部位暴露觀察部位 二甲基亞砜二甲基亞砜(DMSO)(DMSO)割斷法割斷法 環氧樹脂割斷法環氧樹脂割斷法 TF-1TF-1冷凍割斷儀冷凍割斷儀 簡易割斷器簡易割斷器 注入液氮注入液氮 固化包埋固化包埋 割斷割斷 溶化沖洗溶化沖洗取材取材(1(11 15mm)5mm)、

5、前固定、前固定(1%OsO(1%OsO4 4，4 4o oC 1h)C 1h)浸洗浸洗(0.1M PBS(0.1M PBS，10min10min3 3次次 )DMSO DMSO浸泡浸泡(12.5%(12.5%、25%25%、50%50%各各30min)30min)冷凍割斷冷凍割斷 后固定后固定(0。1%OsO4，4 4o oC 30min)C 30min)雙蒸水洗滌雙蒸水洗滌30min30min，2%2%單寧酸單寧酸15min15min2 2次，雙蒸水洗滌次，雙蒸水洗滌30min 30min 1%OsO1%OsO4 4，4 4o oC 30minC 30min，雙蒸水洗滌雙蒸水洗滌30min3

6、0min梯度酒精脫水梯度酒精脫水 二二 生物樣品的干燥生物樣品的干燥除去脫水劑使組織真正干燥，克服表面張力的影響，除去脫水劑使組織真正干燥，克服表面張力的影響，保存樣品表面微細結構保存樣品表面微細結構 無法避免表面張力的影響，僅用于含水較少的樣品無法避免表面張力的影響，僅用于含水較少的樣品 樣品以液氮快速冷凍樣品以液氮快速冷凍 移至真空移至真空 冰升華為汽冰升華為汽 費時費時 低溫損傷低溫損傷 升華介質升華介質坎烯坎烯 4545o oC C以下為固態，室溫中可升華以下為固態，室溫中可升華 標本預處理標本預處理 1:11:1環氧丙烷、坎烯混合液環氧丙烷、坎烯混合液15min 15min 純坎烯純

7、坎烯4545o oC 20min C 20min 室溫，坎烯變為固體，室溫，坎烯變為固體，放入真空、升華放入真空、升華 4.乙腈干燥法乙腈干燥法 標本預處理標本預處理 50%50%、70%70%、80%80%、90%90%、100%100%乙腈溶液各乙腈溶液各20min20min (用乙醇配制用乙醇配制)立即置入真空，乙腈及樣品凍結、升華立即置入真空，乙腈及樣品凍結、升華 干燥效果最好，應用最廣泛干燥效果最好，應用最廣泛 原理原理 物質三相物質三相(固、液、氣固、液、氣)相互轉化，可單相存在，也相互轉化，可單相存在，也可復相存在?？蓮拖啻嬖?。臨界狀態：物質在特定溫度臨界狀態：物質在特定溫度(臨

8、界溫度臨界溫度)時，表時，表面張力系數為零，物質不以液態存在，變成氣體。面張力系數為零，物質不以液態存在，變成氣體。液態液態COCO2 2o2o2 樣品固定、脫水樣品固定、脫水 中間液中間液(醋酸異戊酯醋酸異戊酯)置換置換 樣品置入預冷的樣品室樣品置入預冷的樣品室 注入液態注入液態COCO2 2 CO CO2 2置換置換 臨界處理臨界處理 放氣取樣放氣取樣 方法方法 三三 生物樣品的導電生物樣品的導電(一一)目的目的 避免因樣品表面電荷的積累對二次電子成像的影響避免因樣品表面電荷的積累對二次電子成像的影響(二二)方法方法 在真空噴鍍儀內將金屬加熱、蒸發、噴鍍到樣品表面在真空噴鍍儀內將金屬加熱、

9、蒸發、噴鍍到樣品表面(100-(100-200200)金屬的選擇：顆粒大小不超過金屬的選擇：顆粒大小不超過SEMSEM分辨率分辨率(100(100)；熔點低、易蒸發；熔點低、易蒸發；機械穩定性能好；機械穩定性能好；是好的二次電子發射體是好的二次電子發射體 金金 鉑鉑 金金/鉑合金鉑合金 優點：優點：熱輻射小熱輻射小 顆粒細、噴濺均勻顆粒細、噴濺均勻 金屬消耗少金屬消耗少3.3.導電染色法導電染色法/組織導電技術組織導電技術(TOT)(TOT)利用金屬鹽利用金屬鹽(碘化甲、單寧酸碘化甲、單寧酸)對生物體蛋白質、脂對生物體蛋白質、脂肪的結合作用肪的結合作用 掃描電鏡生物樣品制備的基本程序掃描電鏡生物樣品制備的基本程序