第七章核酸分子雜交技術與核酸序列測定

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1、整理課件第七章第七章 核酸分子雜交技術與核酸核酸分子雜交技術與核酸序列測定序列測定Molecular Hybridization and Blotting Technology 主講教師：主講教師：熊偉熊偉 副教授副教授/博士博士整理課件Content of Table 前前 言言1 1 核酸分子雜交技術的原理核酸分子雜交技術的原理2 2 核酸探針的制備核酸探針的制備3 3 核酸探針的標記核酸探針的標記4 4 核酸分子雜交技術核酸分子雜交技術整理課件 前前 言言整理課件 核酸分子雜交核酸分子雜交 把親源關系較近的，不同生物個體來源的把親源關系較近的，不同生物個體來源的變性變性DNADNA或或R

2、NARNA單鏈，經退火處理形成單鏈，經退火處理形成DNA-DNADNA-DNA或或DNA-RNADNA-RNA這一過程叫這一過程叫分子雜交分子雜交。整理課件 第一節第一節 核酸分子雜交的核酸分子雜交的 基本原理基本原理整理課件一、分子雜交與印跡技術的原理一、分子雜交與印跡技術的原理P44P44整理課件復性復性RNADNA整理課件整理課件 應應 用：用：(1)(1)檢測特定生物有機體之間是否存在檢測特定生物有機體之間是否存在親緣關系；親緣關系；(2)(2)用來揭示核酸片段中某一特定基因用來揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數及表達豐度。的存在與否、拷貝數及表達豐度。Home整理課件整理課

3、件例：例：變性引起紫外吸收值的改變變性引起紫外吸收值的改變DNA的紫外吸收光譜的紫外吸收光譜增色效應：增色效應：DNA變性時其溶液變性時其溶液A260增高的現象。增高的現象。整理課件熱變性熱變性解鏈曲線解鏈曲線：如果在連續加熱如果在連續加熱DNADNA的過程中以的過程中以溫度對溫度對A A260260（absorbanceabsorbance，A A，A A260260代表溶液在代表溶液在260nm260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線鏈曲線。整理課件 Tm：變性是在一個相當窄的溫度范圍內完成，變性是在一個相當窄的溫度范圍內完成，在這一范圍內，

4、紫外光吸收值達到最大值的在這一范圍內，紫外光吸收值達到最大值的50%時的時的溫度稱為溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解的解鏈溫度，又稱融解溫度溫度(melting temperature,Tm)。其大小與。其大小與G+C含量成正比。含量成正比。整理課件整理課件整理課件核酸分子雜交的應用核酸分子雜交的應用研究研究DNA分子中某一種基因的位置分子中某一種基因的位置鑒定兩種核酸分子間的序列相似性鑒定兩種核酸分子間的序列相似性檢測某些專一序列在待檢樣品中存在與否檢測某些專一序列在待檢樣品中存在與否是基因芯片技術的基礎是基因芯片技術的基礎 整理課件 第二節第二節 核酸探針技術及其標記核酸探針技術及其標記

5、 整理課件一、核酸探針的種類和應用一、核酸探針的種類和應用根據核酸性質和檢測目的不同可以分為：（一）基因組DNA探針（二）cDNA探針（三）RNA探針（四）人工合成的寡核苷酸探針最基本的原則是核酸探針與要檢測的核酸之間在核酸序列上要有高度的特異性整理課件 基因組基因組DNA探針探針 真核生物基因組中存在大量的重復序列和非編碼序列，因此選擇基因組DNA做探針時，一定要充分考慮實驗目的性 利用分子克隆或PCR方法可以獲得某一段特定的DNA序列整理課件cDNA探針探針 cDNA是能與mRNA互補的DNA分子，它是利用RNA分子作模板在逆轉錄酶作用下產生的。利用基因克隆的方法可獲得cDNA 優點：cD

6、NA探針不含有內含子序列，尤其適用于基因表達的檢測。整理課件RNA探針探針 RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應效率極高 早期采用的RNA探針是細胞mRNA探針和病毒RNA探針。利用mRNA與基因的 DNA雜交，可以反映出基因的轉錄狀態。整理課件 人工合成的寡核苷酸探針人工合成的寡核苷酸探針 利用DNA合成儀，采用化學方法人工合成寡核苷酸探針整理課件設計寡核苷酸探針的原則設計寡核苷酸探針的原則 1）序列及長度 根據靶分子的序列而定，長度一般為18-50個核苷酸合適。2）堿基成分 一般G+C含量為40%-60%3）探針分子內不存在互補，避免出現“發夾”結構 4）避免單一堿基的重復出現，不超

7、過4個 5）與非靶標區域的同源性不超過70%整理課件 二、探針的標記二、探針的標記放射性和非放射性兩種放射性和非放射性兩種放射性核素：放射性核素：32P、35S和和3H 非放射性標記物：非放射性標記物：1）半抗原：）半抗原：生物素、地高辛素生物素、地高辛素 抗原抗原-抗體反應抗體反應2）配體：生物素）配體：生物素-親和素反應親和素反應3）熒光素）熒光素(整理課件 探針標記方法探針標記方法 核酸分子雜交所用的探針幾乎都用體外標記法標記，分為化學法和酶法 化學法化學法P48：利用標記物分子上的活性基團與探針分子上的基團發生的化學反應直接將標記物結合到探針分子上。特點是簡單、快速、均勻。酶法酶法P4

8、8：將標記物預先標記在核苷酸分子上，然后利用酶促反應將標記的核苷酸分子滲入到探針分子上去，或將核苷酸分子上的標記基團交換到探針分子上。整理課件一個理想的標記物應滿足：(1)(1)標記前后探針基本結構、化學性質相同標記前后探針基本結構、化學性質相同;(2)(2)特異性強、本底低、重復性好；特異性強、本底低、重復性好；(3)(3)操作簡單、節時；操作簡單、節時；(4)(4)安全、無環境污染。安全、無環境污染。整理課件 常用探針的標記方法常用探針的標記方法3.2.13.2.1 缺口平移法缺口平移法3.2.23.2.2 隨機引物標記法隨機引物標記法3.2.33.2.3 末端標記法末端標記法3.2.43

9、.2.4 生物素光照標記法生物素光照標記法整理課件缺口平移法的原理缺口平移法的原理 將將DNAase I 的水解活性與大腸桿菌的水解活性與大腸桿菌DNA polymerase I 的的53的聚合酶活性和的聚合酶活性和5 3的外切酶活性相結合。的外切酶活性相結合。首先用首先用E.coli的的DNAse I 在探針在探針DNA雙鏈上造成缺口，雙鏈上造成缺口，然后再借助于然后再借助于DNA pol I的的53外切酶活性，切去帶有外切酶活性，切去帶有5-磷酸的核苷酸；同時利用該酶磷酸的核苷酸；同時利用該酶53聚合酶活性，使生物聚合酶活性，使生物素或同位素標記的互補核苷酸補入缺口。素或同位素標記的互補核

10、苷酸補入缺口。這兩種活性同時作用，缺口不斷向這兩種活性同時作用，缺口不斷向3方向移動，方向移動，DNA鏈鏈上的核苷酸不斷為標記的核苷酸取代，成為帶有標記的上的核苷酸不斷為標記的核苷酸取代，成為帶有標記的DNA，純化除去游離脫氧核苷酸后成為標記，純化除去游離脫氧核苷酸后成為標記DNA探針。探針。整理課件隨機引物標記法原理隨機引物標記法原理 用一些六核苷酸作為隨機引物，將這些用一些六核苷酸作為隨機引物，將這些引物和探針引物和探針DNADNA片段一起熱變性，退火后，片段一起熱變性，退火后，引物與單鏈引物與單鏈DNADNA互補結合，再在互補結合，再在DNADNA聚合酶的聚合酶的作用下，按堿基互補配對原

11、則不斷在其作用下，按堿基互補配對原則不斷在其3-3-OHOH端添加標記的單核苷酸修補缺口，合成新端添加標記的單核苷酸修補缺口，合成新的標記的探針片段。的標記的探針片段。整理課件末端標記法原理末端標記法原理（1）一種是在）一種是在5末端加成標記法：末端加成標記法：先用堿性磷酸酶（先用堿性磷酸酶（AP）去掉）去掉dsDNA 5-磷磷酸，再用酸，再用T4多核苷酸激酶催化標記的多核苷酸激酶催化標記的ATP 的的-磷酸轉移加到磷酸轉移加到DNA片段片段5-OH上。上。（2）在探針）在探針3-末端用末端轉移酶摻入一個末端用末端轉移酶摻入一個單標記的單標記的-32PdNTP。整理課件生物素光照標記法生物素光

12、照標記法 光敏生物素在紫外線照射下與光敏生物素在紫外線照射下與DNADNA或或RNARNA的堿基發生化學加成反的堿基發生化學加成反應，獲得生物素標記的應，獲得生物素標記的DNADNA探針。探針。整理課件探針的純化探針的純化 1.乙醇沉淀法 用無水乙醇沉淀2-3次 2.SG-50柱層析法 3.微柱離心法整理課件第三節第三節 核酸分子雜交的基本方法核酸分子雜交的基本方法 印跡雜交印跡雜交整理課件印跡雜交印跡雜交 將通過凝膠電泳分離的核酸將通過凝膠電泳分離的核酸片段片段轉移轉移到特定的固相支持物上到特定的固相支持物上,在在轉移過程中，核酸片段保持其原來轉移過程中，核酸片段保持其原來的相對位置不變，然

13、后采用標記的核的相對位置不變，然后采用標記的核酸酸探針探針與結合于固相支持物上核酸片與結合于固相支持物上核酸片段進行段進行雜交雜交的技術。的技術。整理課件 印跡雜交類別：印跡雜交類別：整理課件二、印跡技術的類別及應用二、印跡技術的類別及應用 用于基因組用于基因組DNA、重組質粒和噬菌體的分析。、重組質粒和噬菌體的分析。整理課件分子雜交實驗分子雜交實驗整理課件白瓷盤白瓷盤玻璃板玻璃板濾紙濾紙凝膠凝膠尼龍膜尼龍膜濾紙濾紙吸水紙吸水紙玻璃板玻璃板重物重物吸水紙轉膜吸水紙轉膜整理課件。整理課件真空轉膜槽真空轉膜槽濾紙濾紙尼龍膜尼龍膜凝膠凝膠蓋子蓋子+-真空轉膜真空轉膜整理課件整理課件整理課件South

14、ern印跡法印跡法DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳轉移至硝酸纖維素膜上轉移至硝酸纖維素膜上與放射性標記與放射性標記DNA探針雜交探針雜交放射自顯影放射自顯影帶有帶有DNA片片段的凝膠段的凝膠凝膠凝膠濾膜濾膜用緩沖液用緩沖液轉移轉移DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜整理課件Southern和和Western印跡法印跡法DNA frangmentElectrophoresisTransfer of DNA by blotting32P-labled DNA probeAutoradiographyAgarrose gelAutoradiogramNi

15、trocellulose sheetAutoradiogramPolymer sheetSDS-Polyacrylamide gelTransfer proteinAdd radiolabled spesfic antibody,Wash to remove unboud antibodyProtein band detected by specific antibodyAutoradiography整理課件 整理課件將待檢測蛋白質（或酶）經將待檢測蛋白質（或酶）經PAGE電泳并染電泳并染色后，轉移到濾膜上固定，再用色后，轉移到濾膜上固定，再用“抗體抗體-抗原抗原”免疫反應或免疫反應或“DNA

16、-protein”結合反應鑒別濾結合反應鑒別濾膜上的蛋白質。膜上的蛋白質。整理課件 實驗操作實驗操作 1 細胞裂解物的準備；細胞裂解物的準備；2 細胞裂解物的蛋白定量；細胞裂解物的蛋白定量；3 細胞裂解物的細胞裂解物的SDS-PAGE；4 蛋白質的轉移；蛋白質的轉移；5 目的蛋白質的檢測。目的蛋白質的檢測。蛋白質免疫印跡法蛋白質免疫印跡法整理課件三種印跡技術的比較三種印跡技術的比較整理課件分子雜交實驗分子雜交實驗整理課件放放射射自自顯顯影影照照片片整理課件(四四)斑點印跡雜交和狹線印跡雜交斑點印跡雜交和狹線印跡雜交Dot blotting and slot blotting 適于核酸樣品定量檢

17、測，而不是適于核酸樣品定量檢測，而不是定性檢測。定性檢測。整理課件 (五五)原位雜交原位雜交 in situ hybridization分為菌落、噬菌斑及真核細胞原位雜交分為菌落、噬菌斑及真核細胞原位雜交整理課件 第第 三三 節節 核核 酸酸 序序 列列 分分 析析Nucleic Acid Sequence Analysis整理課件 整理課件核酸序列分析的基本原理核酸序列分析的基本原理化學裂解法化學裂解法(Maxam-Gillbert法法)DNA鏈的末端合成終止法鏈的末端合成終止法(sanger法法)整理課件DNA測序的基本戰略測序的基本戰略 設法產生帶標記的不同長度的成套設法產生帶標記的不同

18、長度的成套DNA片片段，各帶有標記的片段起點相同、終點不同，段，各帶有標記的片段起點相同、終點不同，使待測的使待測的DNA鏈中的相應每個核苷酸處都有斷鏈中的相應每個核苷酸處都有斷裂或終止。通過裂或終止。通過PAGE電泳，能夠將相差一個電泳，能夠將相差一個核苷酸的核苷酸的DNA片段分開，放射自顯影后，根據片段分開，放射自顯影后，根據長短排列，根據特定末端堿基的長短排列，根據特定末端堿基的DNA片段就可片段就可讀出待測讀出待測DNA的堿基序列。的堿基序列。酶法酶法 測序技術進展測序技術進展整理課件 DNA序列分析序列分析（一）（一）雙脫氧終止法雙脫氧終止法 英國英國Sanger 1955 確定牛胰

19、島素結構確定牛胰島素結構,1958 獲諾貝爾化學獎獲諾貝爾化學獎1975 設計出設計出DNA測序測序法法,1980 獲諾貝爾化學獎獲諾貝爾化學獎.合成一段與待測合成一段與待測DNA序列互補的序列互補的DNA片段群。片段群。整理課件整理課件整理課件整理課件DNA的的Sanger測序法測序法(酶法酶法)讀出模板互讀出模板互補序列補序列dNTP 凝膠電泳凝膠電泳 較大片段較大片段 較小片段較小片段ddGTPddATPddCTP ddTTP 反應混合物反應混合物Klenow酶酶 未知序列的單鏈未知序列的單鏈DNA 讀出待測讀出待測序列序列CTGACTTCGACAAAGAA5 3 放射性標記的引物放射性

20、標記的引物TGTTA C T GddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3 5 CTGACTTCGACAA5 3 整理課件DNA的測序儀示意圖的測序儀示意圖computer analysis凝膠中凝膠中DNA移動方向移動方向樣品槽樣品槽激光器激光器輸入光學系統輸入光學系統成象透鏡成象透鏡聚焦透鏡聚焦透鏡高靈敏度相機高靈敏度相機旋光鏡旋光鏡/棱鏡組件棱鏡組件整理課件測序技術進展測序技術進展同位素標記到熒光標記同位素標記到熒光標記,平板電泳到毛細管電泳平板電泳到毛細管電泳多色熒光標記多色熒光標記毛細管電泳毛細管電泳 單色熒光標記單色熒光標記平板電泳平板電泳同位素標記同位素標記平板電泳平板

21、電泳A C G TA C GT測序圖譜測序圖譜T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T整理課件三、三、DNA自動測序自動測序采用熒光替代放射性核素標記是實現采用熒光替代放射性核素標記是實現DNA序列分析自動化的基礎。用不同熒光分子標記四序列分析自動化的基礎。用不同熒光分子標記四種雙脫氧核苷酸，然后進行種雙脫氧核苷酸，然后進行Sanger測序反應，反測序反應，反應產物經電泳（平板電泳或毛細管電泳）分離后，應產物經電泳（平板電泳或毛細管電泳）分離后，通過四種激光激發不同大小通過四種激光激發不同大小DNA片段上的熒光片段上的熒光分子使之發射出四種不同波長熒光，檢測器采集分子使之發射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。堿基的排列順序。整理課件MOV:MCB4.0Dideoxy sequencing of DNA整理課件DNA序列分析儀：序列分析儀：四色熒光基團標記的dNTP整理課件DNA自動測序結果舉例